組織溶解液中の標的タンパク質を推定するための定量的ドットブロット

定量的ドットブロット(QDB)は、サンプル中の標的タンパク質の濃度を定量化するための有用な手法です。サンプルが高分子膜に固定化されると、イムノブロッティングによってタンパク質を検出できます。

まず、QDBプレート(各ウェルの底にニトロセルロース膜が取り付けられたマルチウェルプレート)を取ります。サンプル(標的タンパク質を含む組織溶解物)をウェル内のメンブレンの中央に加えます。

サンプルを乾燥させます。標的タンパク質は、非共有結合性相互作用を介して膜に結合します。

ブロッキング ソリューションを追加します。溶液中のタンパク質は、メンブレン上の非結合部位に付着し、検出試薬の非特異的結合を防ぎます。

次に、サンプル中の標的タンパク質に結合する一次抗体を含む溶液を添加します。洗浄して未結合の抗体を取り除きます。

次に、二次抗体溶液を添加します。これらの分子は、ペルオキシダーゼ酵素で標識され、タンパク質に結合した一次抗体に結合します。洗浄して未結合の抗体を取り除きます。

最後に、化学発光基質と過酸化水素を含む溶液を加えます。過酸化水素を利用して、抗体結合ペルオキシダーゼが基質を酸化し、発光します。プレートリーダーを使用して、サンプルの発光強度を測定します。

標的タンパク質の既知の濃度で段階希釈を使用して、標準的な発光曲線を生成します。サンプルの測定された発光値を曲線上にプロットして、目標タンパク質濃度を決定します。