タンパク質発現レベルを推定するための定量的ウェスタンブロッティング

定量的ウェスタンブロッティング(全タンパク質標準化ベースの手法)は、標的タンパク質の発現レベルを定量化するのに有用です。

まず、組織ライセートをポリアクリルアミドグラジエントゲルのウェルにロードします。ライセートには、他の細胞タンパク質とともに標的タンパク質が含まれています。

グラジエントに沿ってサンプルタンパク質を電気泳動で分離するための適切な電圧でゲルを泳動します。完了したら、転写スタックのポリマーメンブレンの上にゲルを置きます。

電流を流して、分離したタンパク質をメンブレンに移します。次に、メンブレンを蛍光総タンパク質染色液に置きます。染色剤中の荷電した色素分子は、メンブレン上のすべてのタンパク質に静電的に結合します。

ブロッキング ソリューションを追加します。したがって、溶液中のタンパク質は膜に結合します。検出試薬の非特異的結合を防止します。標的タンパク質にのみ結合する一次抗体を添加します。次に、一次抗体に付着する二次抗体(蛍光色素で標識)を添加します。

レーザーでサンプルを励起します。全タンパク質染色試薬の色素分子と抗体結合蛍光色素分子から放出された蛍光を、対応する波長で記録します。

正規化されたタンパク質ローディング値を計算するには、各レーンの総タンパク質シグナルを最大値で除算します。標的タンパク質シグナルを対応する正規化されたローディング値で除算して、標的タンパク質の相対的発現を決定します。