タンパク質プロセッシングのための化学発光ウェスタンブロットアッセイ

CD95(死の受容体)は、そのアゴニスト抗体に結合し、プロカスパーゼ8を動員する多タンパク質複合体である死を誘発するシグナル伝達複合体(DISC)の組み立てを引き起こします。DISCでは、プロカスパーゼ8が二量体化して処理し、さまざまな中間切断産物を形成し、最後にアポトーシスを開始する活性型を形成します。

化学発光ウェスタンブロッティングを使用してカスパーゼ8プロセッシングを解析するには、カスパーゼ8のDISC関連中間切断産物を含むライセートをチューブ内に取ります。これにプロテインA-アガロースビーズ捕捉抗CD95抗体を添加します。抗CD95抗体は、DISC成分であるCD95に結合し、タンパク質複合体を形成します。

サンプルをSDS-ポリアクリルアミドゲルにロードして、異なるサイズの免疫沈降カスパーゼ8中間体を個別のバンドとして分離します。ゲルをブロッティングメンブレンに置き、電流を流します。カスパーゼ8中間体は、ゲルからブロッティングメンブレン上に移動します。

メンブレンをブロッキングタンパク質含有溶液で処理して、タンパク質結合部位を飽和させ、非特異的結合を防ぎます。

特定の部位でカスパーゼ-8製品に結合する一次抗体の溶液を添加します。

一次抗体の相補的Fc領域に特異的に結合する酵素タグ付き二次抗体を添加して、カスパーゼ-8切断産物-一次抗体-二次抗体複合体を形成します。

二次抗体標識酵素と反応して発光する化学発光基質を添加します。放出される光の強度は、カスパーゼ-8切断生成物の量と相関します。