マウス胚性幹細胞ゲノムにおける相同組換えを検出するためのサザンブロッティング

サザンブロッティングでは、プローブベースの検出により、複雑なDNA混合物から特定のDNA配列を同定します。

サザンブロッティングを用いてマウス胚性幹細胞の相同組換えまたはHRイベントを同定するには、細胞からゲノムDNAを取得します。制限酵素とインキュベートして、DNAをより小さな断片に消化します。

DNAをアガロースゲルにロードします。サイズベースのフラグメント分離のための電気泳動を行います。

ゲルを酸性溶液で処理してプリン塩基を除去し、二本鎖DNA、dsDNAを緩めます。アルカリ性変性液を添加します。pHが高いと水素結合が破壊され、緩んだdsDNAが一本鎖DNA(ssDNA)に変性します。中和溶液とインキュベートして、ゲルのpHを中和します。

ブロッティングペーパー、ナイロンメンブレン、およびメンブレンの上に積み重ねたゲルを使用して、転写システムを組み立てます。転送を実行します。ssDNAは、下向きの毛細管現象を介してゲルからメンブレンに移動します。

メンブレンに紫外線を照射し、DNAを架橋して固定化します。ハイブリダイゼーション溶液を含むチューブにメンブレンを置きます。回転させてインキュベートし、メンブレンをコーティングし、非特異的プローブの結合を防ぎます。

最後に、一本鎖放射性標識プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーとメンブレンをインキュベートします。プローブは、配列相補性を介して特定のDNA領域に結合します。

メンブレンを洗浄し、結合していないプローブを取り除きます。メンブレンをX線にさらします。メンブレン上の明確なバンドは、HRイベントを含むDNA領域とコントロール領域を区別します。