組織溶解液中の標的タンパク質を推定するための定量的ドットブロット
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この手順では、プレートの底がテーブル表面に触れないように、空のピペットチップボックスをQDBプレートの下に置きます。最大2マイクロリットルのサンプルを、QDBプレートの個々のユニットの下部にあるメンブレンセンターにロードします。
ロード中は、QDBプレートの底部が表面に触れないようにし、個々のウェルに負荷をかけすぎないでください。あなたは井戸あたり4マイクロリットル以下しか経験していません。
次に、負荷をかけたQDBプレートを室温で1時間放置するか、負荷したプレートを摂氏37度で15分間換気の良い場所に置いておきます。プレートをブロックするには、QDBプレートをトランスファーバッファーに浸し、10秒間静かに振とうします。
その後、QDBプレートをTBSTで3回優しくすすぎ、TBSTでプレートを絶えず振とうしながら5分間洗浄します。その後、QDBプレートをブロッキングバッファーで1時間、絶えず振とうしながらブロックします。次に、ブロッキングバッファー中の一次抗体を選択した濃度で希釈し、通常の96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルを加えます。
QDBプレートを96ウェルプレートに挿入し、組み合わせたプレートを室温で2時間、または摂氏4度で一晩、絶えず振とうしながらインキュベートします。その後、TBSTでプレートを3回やさしくすすいでから、TBSTで3回、絶えず振とうしながら毎回5分間洗浄します。
次に、ブロッキングバッファー中の二次抗体を選択した濃度で希釈し、96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルを分注します。次に、ロードした96ウェルプレート内のQDBプレートを室温で1時間、一定の振とう下でインキュベートします。QDBプレートをTBSTで3回優しくすすぎ、次にTBSTでプレートを3回、TBSTで5分ずつ、絶えず振とうしながら洗浄します。
定量のために、ECL基質と分注をウェルあたり100マイクロリットルで96ウェルプレートに調製します。次に、QDBプレートを96ウェルプレート内に2分間挿入し、絶えず振とうします。その後、96ウェルプレートからQDBプレートを取り外し、短時間振とうして余分な液体を取り除きます。その後、プレートを白いマイクロタイタープレートに置きます。次に、マイクロプレートリーダーの電源を入れ、ユーザーインターフェースでカバー付きプレートを選択してから、組み合わせたプレートをマイクロプレートリーダー内に置いて定量化します。
