Name: ヒト膵臓癌異種移植片由来の幹細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学ぶヒト膵管腺がん異種移植片からのがん幹細胞分離法。ALDH活性とCD44・CD24マーカーを用いたフローサイトメトリーにより、生存可能なCSCを単離し、機能解析や遺伝子解析などの下流アプリケーションに利用できます。

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この作品は、WMに国立衛生研究所からの補助金（CA127574、CA107040とCA09071）によってサポートされていました

1。マウスから収穫の異種移植<ol><li>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）10％ウシ胎児血清（FCS）、ペニシリン - ストレプトマイシン、200 U / mLのコラゲナーゼIV型、および0.6 U / mLのディスパーゼを添加した：細胞解離バッファーを準備します。 </li><li>最大直径1cm未満である皮下ヒト膵臓癌異種移植を保有する無胸腺（NU + / NU +）マウスは、二酸化炭素の窒息と頸椎脱臼により安楽死させています。 </li><li>皮下腫瘍は​​、鉗子とハサミを用いて鈍的切開によってマウスの脇腹から採取し、細胞解離緩衝液中で直後に配置されます。 </li><li>腫瘍の重量を測定し、腫瘍組織の1グラムあたり10 mLの細胞解離バッファーに戻されている。 </li></ol> 2。異種移植片からの単一細胞懸濁液を生成する<ol><li>無菌バイオセーフティーキャビネットでの作業、腫瘍は細胞解離緩衝液1 mLと100 × 20 ​​mmの培養皿に転送されます。腫瘍は、機械的に無菌のかみそりの刃やピンセットを使って刻まれている。腫瘍細胞懸濁液を5 mLの血清学的ピペットを通して10回トリチュレートしています。腫瘍の部分は、5 mLの血清学的ピペットを詰まらせないために十分小さくする必要があります。 </li><li>腫瘍細胞懸濁液は、細胞解離バッファー（塗りつぶされた50％未満）の残りのボリュームを含む50 mLコニカルチューブに移し、1分間最大速度でボルテックスしています。 </li><li>腫瘍細胞懸濁液は、℃で2時間1分毎に20分間断続的にボルテックスしながら37℃でインキュベートされる。 </li></ol> 3。組織破片及び死細胞の細胞懸濁液を使い果たす<ol><li> 2時間のインキュベーション後に細胞懸濁液は、1分間の最大速度でボルテックスしています。 </li><li>細胞懸濁液を70μmのフィルターを通し、新鮮な50 mLコニカルチューブに回収し、チューブ当たり15 mlの最終量に調整されます。 </li><li>死んだ細胞や組織の残骸からさらに別の生細胞に、腫瘍細胞懸濁液をFicoll - Paque Plusを使用して密度遠心分離によって分離される。をFicoll - Paqueプラスの下敷きは、プラス徐々に二つの層を混在しないように注意して細胞懸濁液の下をFicoll - Paque 15mLをペッティングすることによって作成されます。 </li><li>ブレーキをオフにして細胞懸濁液とフィコール層は30分間500分の1 gで遠心分離されています。 </li><li>をFicoll - Paqueプラスと細胞解離バッファーの界面で細胞を回収し、新鮮な50 mLコニカルチューブに移しています。 </li><li>新鮮なDMEMに10％FCSを添加することは、それを希釈するために細胞懸濁液に添加される1:3（例：20mLの新鮮な培地は、細胞懸濁液を10mLに追加された）。 </li><li>細胞を10分間、450 gで遠心分離によって収集され、メディアはデカントし、細胞ペレットは、ALDEFLUOR緩衝液1 mLに再懸濁する。 </li><li>細胞懸濁液10μlを10μLトリパンブルーと生細胞血球計数器を使用してカウントしているで希釈する。死んだ細胞や組織の破片が多数このステップ中に明記されている場合は、密度遠心分離による細胞の分離は、（ - 3.7ステップ3.3）を繰り返すことができます。 </li></ol> 4。蛍光活性化細胞選別のための細胞を染色<ol><li>としてラベルseven 12 × 75 mmのポリスチレン試験管は次のとおりです。 <ol><li>汚点のない</li><li> CD44 - APC </li><li> CD24 - PE </li><li>マウスCD31 -ビオチン+マウス系統-ビオチン+マウスH - 2KD -ビオチン</li><li> ALDEFLUOR </li><li> ALDEFLUOR + DEAB + IgG抗体2bκ- APC + IgG抗体2aκ- PE </li><li> ALDEFLUOR + CD44 - APC + CD24 - PE +マウスCD31 -ビオチン+マウス系統-ビオチン+マウスH - 2KD -ビオチン。 </li></ol></li><li>百万円50〜10細胞/ mLの最終濃度にALDEFLUORの緩衝液2 mLの細胞懸濁液を希釈し、氷上に置きます。チューブ＃1、2、3、および4に細胞懸濁液100μLを加え、氷上で保管して下さい。チューブ＃1〜6μLDEABを追加し、氷上に置きます。 1000希釈、残りの細胞懸濁液にALDEFLUOR試薬を追加 - 倍（例えば1.6 mLの細胞懸濁液1.6μLALDEFLUOR試薬を加える）、よく混ぜて、そして氷上に置きます。チューブ＃7に100チューブ＃5と6にこの混合物のμL、および残りの混合液（1.4 mL）を転送する。 40分37℃の水浴中でチューブのすべてをインキュベートする。チューブの底に沈降する細胞を防止するために細胞懸濁液は10分ごとに混ぜる。 </li><li> 450 gでのセルと4を遠心℃で10分間、その後バッファーをデカントするため。 100μLALDEFLUORバッファー中で1位と5管でペレットを再懸濁します。チューブ＃2、3、4、および6に、次のように希釈し、適切な抗体を含むALDEFLUOR緩衝液100μLを追加します。IgG抗体2bΚ- APC、IgG抗体2aΚ- PE、CD44 - APC、およびCD24 - PEの1時20分抗体、マウスCD31 -ビオチン、マウス系統-ビオチン、およびマウスH - 2KD -ビオチン抗体の1:100。チューブ＃7を追加CD44 - APCの1:20希釈を含むALDEFLUORバッファー1.4 mLを加え、CD24 - PE抗体とマウスCD31 -ビオチン、マウス系統-ビオチン、およびマウスH - 2KD -ビオチンの1:100希釈へ抗体。 10分間氷上で細胞懸濁液をインキュベートする。 </li><li> 450 gでのセルと4を遠心℃で10分間、その後バッファーをデカントするため。チューブ＃1、2、3、5、および100μLALDEFLUORバッファ6にペレットを再懸濁します。ストレプトアビジン- PerCP蛋白質の100倍希釈液を含むALDEFLUORバッファーを1.5 mlを準備します。チューブに100μLを追加して＃4とチューブ＃7に1.4 mLを加える。 10分間氷上で細胞懸濁液をインキュベートする。 </li><li> 450 gでのセルと4を遠心℃で10分間、その後バッファーをデカントするため。チューブ＃1、2、3、4、5、および200μLALDEFLUORバッファ6にペレットを再懸濁します。濃度2μg/ mLのヨウ化プロピジウムを含むALDEFLUORバッファー2.8 mLのチューブ＃7でペレットを再懸濁する。すべての回でチューブを氷中に保管してください。 </li><li>ストレーナーのキャップで12 × 75 mmのポリスチレン試験管を用いて35μmのフィルターを介して細胞を渡します。 </li></ol> 5。蛍光活性化細胞選別により、がん幹細胞を分離<ol><li> FACSAriaフローサイトメーターは、細胞選別のために準備されます。 </li><li>補償のコントロールは、チューブ＃1、2、3、4、および5からセルを使用して設定されます。 </li><li>ゲイツは、細胞のシングレットを収集するために前方および側散乱パラメータに基づいて作成されます。 </li><li>非マウス（PerCP陰性）と実行可能な（非ヨウ化プロピジウムで染色）細胞は、FL - 3チャンネルを使用してゲートです。 </li><li> DEAB処理した細胞（チューブ＃6）とFL - 1チャンネルを使用して作成されたALDH +細胞は、ゲートに基づいて収集されます。 </li><li> CD44 + CD24 +細胞は、ゲートに基づいて収集されているFL - 4とFL - 2チャネルを使用してALDEFLUOR、IgG抗体2bΚ- APC、およびIgG2aκ- PE（チューブ＃6）で染色した細胞を使用して作成した。 </li><li>細胞を10％FCSを補充したDMEM 1mLを含む12 × 75 mmのポリスチレン試験管に集められています。 </li><li>細胞がソートされた後、デカント10分、メディアのために450 gで細胞懸濁液を遠心し、500μLの新しいDMEMに懸濁し、10％FCSを補充した。 </li><li>としてステップ3.8節血球計数器を用いて選別された細胞の数を数えます。 </li></ol> 6。代表的な結果このプロトコルは、ALDH +とCD44 + CD24 +膵臓のCSCの分離につながる。マウス由来の細胞の割合は可変ですが、我々は、ほとんどのヒト膵臓癌の異種移植片は、マウスCD31を用いて、マウス由来の細胞、マウスの系統のカクテル、そしてマウスH - 2KDビオチン標識抗体（図1A 20〜60％が含まれていることを見出した）。同様に異なる異種移植片から各CSCの人口の周波数は可変であるが、一般的に我々は、総細胞集団の1-4％がALDH +（図1B）であり、0.2から5パーセントは、CD44 + CD24 +（図1C）であることを見出した。 FACSAriaのマシンの数がしばしば原因FACSAriaによって検出される非細胞性粒子に不正確なので、我々は日常的に手動で血球計数器を使用してソートされた細胞を数える。 <img src="/files/ftp_upload/2169/2169fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。膵臓癌の異種移植片からの特定の集団を描いた、フローサイトメトリープロット。（）FL - 3チャネル（ヨウ化プロピジウム+、マウスCD31 +マウスの系統+、またはマウスH - 2KD +）に積極的に染色細胞は分離するように除外されています実行可​​能と非マウス由来の細胞。 （B）ヒト膵臓癌異種移植におけるALDH活性はALDH1の阻害剤ジエチルアミノベンズアルデヒド（DEAB）の存在下および非存在下でALDEFLUOR試薬を用いたフローサイトメトリーにより測定した。フレームは、DEAB処理した細胞に基づいて作成し、未処理の細胞に適用されたALDH +細胞を描くゲートを表しています。 ALDH +細胞の割合がゲートに示されています。 （C）CD44 + CD24 +ゲートは、ALDEFLUORで染色した細胞、およびIgG2bκ- APC（CD44 - APC用アイソタイプコントロール）およびIgG2aκ- PE（CD24 - PEのアイソタイプコントロール）抗体に基づいて作成されました。 CD44 + CD24 +細胞の割合は、ゲートに示されています。

<ol><li>Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells--perspectives+on+current+status+and+future+directions%3A+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Res. 66, 9339-9344 (2006).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ginestier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+Is+a+Marker+of+Normal+and+Malignant+Human+Mammary+Stem+Cells+and+a+Predictor+of+Poor+Clinical+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 Is a Marker of Normal and Malignant Human Mammary Stem Cells and a Predictor of Poor Clinical Outcome.</a> Cell stem cell. 1, 555-567 (2007).</li>
<li>Jones, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+clonotypic+B+cells+in+classic+Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Circulating clonotypic B cells in classic Hodgkin lymphoma.</a> Blood. 113, 5920-5926 (2009).</li>
<li>Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonogenic+multiple+myeloma+progenitors%2C+stem+cell+properties%2C+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clonogenic multiple myeloma progenitors, stem cell properties, and drug resistance.</a> Cancer Res. 68, 190-197 (2008).</li>
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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルは、ヒトの異種移植片からの膵臓のCSCの分離を説明します。この手順では、いくつかの重要な手順は、実行可能なCSCがの収量を向上させます。膵臓のCSCの純粋な人口の回復はFACSAriaでの並べ替えの前に細胞懸濁液中に存在する生細胞の純度に依存しています。最大直径1センチ未満の異種移植片を使用するように注意しながら腫瘍の中心部に壊死組織の量を減らすのに役立ちます。さらに、をFicoll - Paque勾配遠心分離時の組織の残骸や死細胞の細胞懸濁液を破壊することは非常に重要ですし、細胞を血球計でカウントされているときに組織の破片や非生存細胞の数が多いが検出された場合に繰り返すことができます。 ここで説明する染色のプロトコルは、特定の細胞表面抗原を検出するためのALDH活性だけでなく、蛍光色素標識抗体を検出するためにALDEFLUOR試薬のシステムを利用しています。 ALDEFLUOR染色は37℃と、それゆえ、37℃で起こることができる、キャッピング抗体の可能性を防ぐために（氷上）抗体染色の前に完了する必要がある℃を実行される細胞がALDEFLUOR試薬を排出できるので、それがALDEFLUORの染色が完了した後4℃でALDEFLUORバッファーで細胞を維持することが重要です。 ALDEFLUORバッファーはALDEFLUORの細胞内レベルを維持できるように薬剤排出抑制剤が含まれています。 このメソッドは実行可能な膵臓CSCを分離するので、それらはこれらの細胞の生理的機能を測定する実験の数に適用することができます。我々は、免疫不全マウスおよびin vitroでの細胞移動/浸潤アッセイを利用した腫瘍イニシエーションアッセイのためにこれらの細胞を使用している。さらに、RNA、DNA、及びタンパク質は、CSCと非CSC集団を比較分析研究のためにこれらの細胞から採取することができる。

<table><tbody><tr><td>DMEM </td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>胎児牛血清 </td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT-9501</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン </td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ type IV </td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm 培養皿 </td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>70-&amp;mu;m フィルター </td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>50-mL コニカルチューブ </td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus </td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440</td><td></td></tr><tr><td>ALDEFLUOR 試薬システム </td><td>Stem Cell Technologies</td><td>01700</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー </td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm ポリスチレン試験管 </td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>CD44-APC (clone G44-26) </td><td>BD Biosciences</td><td>559942</td><td></td></tr><tr><td>CD24-PE (clone ML5) </td><td>BD Biosciences</td><td>555428</td><td></td></tr><tr><td>マウス CD31-biotin </td><td>BD Biosciences</td><td>553371</td><td></td></tr><tr><td>マウス lineage-biotin </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-613</td><td></td></tr><tr><td>マウス H-2Kd-biotin </td><td>BD Biosciences</td><td>553564</td><td></td></tr><tr><td>IgG&lt;sub&gt;2b&amp;#954;&lt;/sub&gt;-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555745</td><td></td></tr><tr><td>IgG&lt;sub&gt;2a&amp;#954;&lt;/sub&gt;-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555574</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-PerCP タンパク質 </td><td>BD Biosciences</td><td>554064</td><td></td></tr><tr><td>プロピジウムヨード </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>ストレーナーキャップ付き 12 x 75 mm ポリスチレン試験管 </td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト膵臓癌異種移植片由来の幹細胞の分離

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

がん幹細胞（CSC）が悪性腫瘍の増加に同定されており、機能的に自己再生を受け、分化した子孫1を生成する能力によって定義されます。これらのプロパティは、免疫不全マウスに注入するとCSCは、元の腫瘍を再現することができます。上皮悪性腫瘍内のCSCは、最初の乳癌で記述し、特定の細胞表面抗原の発現（CD44 + CD24 低/ - ）を表示することが見出された2。それ以来、CSCは、CD44とCD24を使用して、他のヒト悪性腫瘍の増加だけでなく、他の表面抗原の数で確認されている。アルデヒド脱水素酵素（ALDH）活性、生理的な特性は、、また悪性組織3月5日からCSCを分離するために使用されています。 最近、我々と他の人はALDH活性と細胞表面抗原CD44とCD24、およびCD133 6-8の発現に基づいて、膵臓腺癌からCSCを同定した。これらの高度に腫瘍発生の集団はまたは重複になると他の機能が表示されない場合があります。我々が発見したALDH +とCD44 + CD24 +膵臓のCSCは、同様に腫瘍形成であるが、ALDH +細胞は、比較的多くの侵襲的な8である。このプロトコルでは、継代数の低い人間の異種移植片9から実行可能な膵臓CSCを分離する方法を説明します。異種移植腫瘍は、マウスから採取し、単一細胞懸濁液に作られています。組織の残骸や死細胞は生細胞から分離し、CD44とCD24に対する抗体を使用し、ALDEFLUOR試薬、ALDH 10の蛍光基質を用いて染色される。 CSCは、蛍光活性化細胞選別によって分離されています。隔離されたCSCはその後、生細胞を必要とする分析的または機能的アッセイに使用することができます。

がん幹細胞（CSC）が悪性腫瘍の数が同定されている。このプロトコルでは、ヒト膵臓腺癌の異種移植片からCSCを分離するアルデヒド脱水素酵素活性とCD44とCD24の発現を利用したフローサイトメトリー法を説明します。これらの生細胞は、機能的分析の研究で使用することができます。

がん幹細胞（CSC）は、増え続ける多くの悪性腫瘍で同定されており、自己複製能を有することによって機能的に定義されています...

がん幹細胞（CSC）は、長期的な自己複製能と分化した子孫細胞を産生する能力を備えています。CSCは、膵管腺癌を含む増え続ける多くの悪性腫瘍で同定されており、膵管腺癌においてはアルデヒド脱水素酵素活性および細胞表面抗原であるCD 44、CD 24、CD 1 33の発現に基づいて同定することが可能です。本手順では、ヒト膵癌を移植したマウスから腫瘍を単離します。異種移植片および単一細胞懸濁液を調製します。次に、細胞をeldor試薬で染色し、アルデヒド脱水素酵素活性が高い細胞、および細胞表面抗原CD 44およびCD 24を同定します。その後、蛍光活性化細胞分取（FACS）を用いて、がん幹細胞集団を分離します。単離された細胞は、さまざまなダウンストリームの機能的および分析的アッセイに使用できます。幹細胞仮説は、がん生物学における新興の領域です。本質的に、この仮説は、腫瘍が表現型および機能的に異なる細胞のサブセットを含んでいることを述べています。腫瘍開始細胞またはがん幹細胞と呼ばれる特定の細胞サブセットは、免疫不全マウス内での腫瘍形成や、in vitroの同系アッセイにおけるコロニー形成能を有しています。近年では、がん幹細胞は転移の発達や治療抵抗性においても重要な役割を果たしていると考えられています。もともと、がん幹細胞の研究は末梢血または骨髄検体を用いた骨髄性白血病において行われていました。しかし、幹細胞生物学や固形腫瘍の研究が進むにつれ、フローソートを行い、その後のアプリケーションで解析可能な単一細胞懸濁液を調製するという課題が生じてきました。私のポストドクター研究員であるZanが、これからこの手順を実演します。このプロトコルの重要なステップをいくつか視覚的に解説します。まず、ヒト膵がんゼノグラフトから腫瘍細胞の単一懸濁液を調製します。次に、アルデヒド脱水素酵素活性およびいくつかの細胞表面抗原について細胞を染色します。最後に、蛍光活性化セルソーターを用いて細胞を分取します。本プロトコルで使用するマウスは、ヒト膵がんの皮下異種移植片を保有しています。これらのマウスは、以下の方法で作成されました。ジョンズ・ホプキンス病院で膵管腺がんの手術を受けた患者から採取した新鮮な腫瘍を2〜3 mmの大きさに細切し、6週齢の胸腺欠損マウスの側腹部に皮下移植しました。腫瘍が約1.5 cubic centimetersに達した時点で、それらを切除し、腫瘍プールを拡大するために二次レシピエントマウスに移植しました。本プロトコルでは、まず鈍的剥離法により、抗原提示マウスの側腹部から皮下腫瘍を採取することから始めます。腫瘍を摘出した後、直ちに細胞解離バッファーに投入してください。次に、腫瘍の重量を測定し、滅菌済みのバイオセーフティーキャビネット内で、腫瘍組織1gあたり10mLの細胞解離バッファーに再び戻します。滅菌済みのカミソリとピンセットを用いて、腫瘍を1mLの細胞解離バッファーを含む100×20mmの培養皿に移します。腫瘍を機械的に細切します。腫瘍細胞懸濁液を、残りの細胞解離バッファーが入った50 mLコニカルチューブに移します。次に、腫瘍細胞懸濁液を5 mLセロロジカルピペットで10回トリチュレーションします。5 mLセロロジカルピペットが詰まらないよう、腫瘍の断片を小さくしておき、その後、懸濁液を最大速度で1分間ボルテックスします。次に、腫瘍細胞懸濁液を37°Cで2時間インキュベートし、20分ごとに1分間ボルテックスします。2時間のインキュベート後、細胞懸濁液を最大速度で1分間ボルテックスします。細胞懸濁液を70 µmフィルターに通し、新しい50 mLコニカルチューブに回収します。生存細胞を死細胞や組織片からさらに分離するため、10% FBSおよびpen stripを含むDMEMを用いて最終容量を15 millilitersに調整します。密度勾配遠心分離による分離のためのFicoll-Paque Plus勾配を作成するため、Ficoll-Paque Plus 15 millilitersを細胞懸濁液の下にゆっくりとピペッティングします。2つの層が混ざらないように注意し、ブレーキをオフにした状態で、室温にて500 Gで30分間遠心分離します。遠心分離後、生存細胞はFicoll-Paque Plusと細胞解離バッファーの界面に回収されます。それらを新しい50 milliliterのコニカルチューブに移します。分離した細胞懸濁液に10%FBSを添加した新鮮なDMEMを加え、3倍に希釈します。分離した細胞を室温で450 G、10分間遠心分離します。遠心分離後、細胞ペレットをalor染色キットに付属しており、以降の細胞染色工程で使用する1 milliliterのalorバッファーで再懸濁します。次に、細胞懸濁液10 microlitersを10 millilitersのtrian blueで希釈し、ヘモサイトメーターを用いて生存細胞数をカウントします。このステップで大量の死細胞または組織破片が認められた場合は、細胞分離を繰り返してください。密度勾配遠心分離によって分離した細胞を、アルデヒド脱水素酵素活性のために染色します。AldeFluor試薬を用い、さらに特定のフルオロクローム標識抗体を用いて、いくつかの細胞表面抗原についても細胞を染色します。7本の12×75 mmポリスチレン製試験管にラベルを貼り、氷上に置きます。細胞懸濁液を2 mLのeldor緩衝液で希釈し、最終濃度を1 mLあたり500万〜1,000万個に調整して氷上で保持します。次に、付属の書面プロトコルの指示に従い、以下のサンプルを調製して、FACS装置の補正コントロールを設定します。フローサイトメーターを用いて、まず非特異的染色（non-ST）のコントロール細胞を測定します。次に、CD 44 APCで染色した細胞、3つ目にCD 24 PEで染色した細胞、そして4つ目にマウスCD 31 biotin（マウス系譜、biotinマウス、H two KD、biotinおよびstreptavidin per cp）で染色した細胞を測定します。また、ALORのみを含む5つ目のサンプルと、ALDH陽性およびCD 44陽性/CD 24陽性ゲートを設定するための6つ目のサンプルも準備してください。このサンプルには、アルデヒド脱水素酵素の阻害剤であるELDOR DEAB、アイソトピックコントロール抗体、IgG2b κ APC、IgG2a κ PE、マウスCD31 biotin、マウスlineage biotin、マウスH2-K^d biotin、およびstreptavidin per cpが含まれます。その後、最後のチューブで、CD44 APC、CD24 PE、マウスCD31 biotin、マウスlineage biotin、マウスH2-K^d biotin、およびstreptavidin per cpを用いて細胞を染色します。これは、すべての染色が完了した後にソートを行う実際の検体です。細胞ソートが実施されるまで、チューブを遮光して氷上に保持してください。このソートプロトコルにより、ALDH陽性、CD44陽性、CD24陽性の膵臓CSCが単離されます。ソートの直前に、2 mg/mLのプロピジウムイオダイドをALDH陽性、CD44陽性、CD24陽性のゲーティングチューブに加え、非染色CD44 APC CD24 PEマウスリネージおよびALDH細胞を用いて生存していない細胞をゲートアウトします。FIAフローでコンペンセーションコントロールを設定してください。サイトメーターを用い、前方散乱光および側方散乱光のパラメータに基づいてゲートを設定し、シングルレット（単一細胞）を回収します。非ST染色チューブおよびマウスリネージュチューブを用いて、FL3チャンネルで、non-use per CP陰性かつプロピジウムイオダイド陰性の生存細胞を抽出するためのゲートを作成します。ほとんどのヒト膵がんゼノグラフトには、マウスCD31マウスリネージュカクテルおよびマウスH2-Kdを用いた解析で、20～60%のマウス由来細胞が含まれています。DEAB処理した細胞にビオチン標識抗体を用いることで、ALDH陽性細胞に対するFL1チャネルのゲートを設定します。異なる異種移植片におけるALDH陽性細胞集団の頻度は変動しますが、一般的に全細胞集団の1〜4%となります。その後、細胞をソート用のfaxポートに導入し、これらのゲートを用いて分取を行います。10% FBSを添加したDM EM 1 mLを含む12×75 mmポリスチレン試験管に、LDH陽性細胞を回収します。次に、FL4およびFL2チャネルにおいて、eldor IgG2Bκ APCおよびIgG2aκ PEで染色した細胞を用いてゲートを作成します。その後、全細胞集団の通常0.2〜5%を占めるCD44陽性CD24陽性細胞を、各細胞集団のソート後に回収します。細胞懸濁液を450 Gで10分間遠心分離し、10% FBSを添加した新鮮なDMEM 500 millilitersで細胞を再懸濁させ、ヘモサイトメーターを用いて分取した細胞数を計測します。この手順により、生存可能な膵臓CSCが単離されます。これらの細胞は、生存細胞を必要とする多くの分析的および機能的アッセイに使用できます。我々は、これらの細胞を用いてin vitroでのクローン形成能および浸潤能を測定してきました。また、in vivoでの腫瘍形成および転移形成を測定し、さらに比較遺伝学的解析を行うためにも使用してきました。この技術を習得すれば、約7時間で実施することが可能です。生存細胞の純粋な集団を得るためには、いくつかの重要なステップがあります。まず、最大径が1 cm未満のゼノグラフトは、腫瘍内の壊死組織が最も少なくなります。これにより、最終的に単離される細胞集団に混入する非生存細胞や組織残渣を最小限に抑えることができます。第二に、腫瘍細胞の単一懸濁液を調製する際は、迅速に作業を行い、細胞の生存率を高めるために10% serumを添加した培地中で細胞または腫瘍を保持することが重要です。第三に、Aldefluor試薬および抗体を用いて細胞染色を開始した後は、細胞からAldefluor試薬が流出する量を抑えるため、細胞を氷上に保持し、Aldefluor緩衝液中に浸したままにすることが重要です。さらに、蛍光色素の光退色を抑えるため、可能な限り細胞を遮光状態で保持することが重要です。最後に、ヘモサイトメーターを用いて手動で細胞数をカウントすることが重要です。フローサイトメーターでは、細胞数が不正確になることが多いためです。

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