共培養モデルの緑膿菌バイオフィルム

本論文では、成長の異なる方法を説明します

この手順の全体的な目標は、生きたヒト気道上皮細胞の頂端表面でシュードモナス好気性バイオフィルムを成長させることです。これは、最初に気道上皮細胞のコンフルエント単層をプラスチック表面またはガラスカバースリップ上に確立することによって達成されます。手順の第2ステップは、緑色蛍光タンパク質を発現するp好気性細菌の培養物を構成的に増殖させることです。

次のステップは、細菌と気道細胞を静的な環境またはフローチャンバー内で互いに接触させることです。手順の最後のステップは、気道細胞の生存率を評価しながら、細菌のバイオフィルムを時間の経過とともに発達させることです。蛍光顕微鏡法により、生きた気道細胞上のバイオフィルム形成を示す結果を得ることができます。

これらの共培養モデルを使用して、気道の慢性的なコロニー形成に関与するバイオフィルムを根絶できる新しい抗生物質レジメンを開発および検証できるため、この技術の意味は嚢胞性線維症患者の治療にまで及びます。嚢胞性線維症患者では、静的共培養バイオフィルムモデルは、不死化されたヒト気道であるCFBE細胞を使用します。上皮細胞は、もともと細菌接種の7〜10日前に嚢胞性線維症の個人から発生し、24ウェル組織培養プレートでCFBE細胞を播種します。

我々は、10%のウシ胎児血清2ミリモルL-グルタミン、50ミリリットル/ミリリットル、ペニシリンおよび50マイクログラム/ミリリットルを補充した最小必須培地またはMEMの0.5ミリリットルでウェルあたり10〜5番目の細胞の2倍の濃度で細胞を播種する。ストレプトマイシンは、摂氏37度と二酸化炭素5%で細胞を成長させます。95%AIRは7〜10日間、2〜3日ごとに媒体を交換します。

これらの条件により、実験の1日前にコンフルエントジャンクション、単層ジャンクション、およびタイトジャンクションが形成されます。凍結ストックから5ミリリットルのLB培養物にピエロゲンを接種し、ローテーターで摂氏37度で18時間増殖させます。200 RPMでは、PSMC 21プラスミドを運ぶpエアロゲンを使用して、細菌接種の日にGFPを構成的に発現します。

CFPE細胞から培地を取り出し、フェノールレッドを含まないMEMである等量の顕微鏡培地を、2ミリモルのL-グルタミン接種コンフルエンス、CFBE単層とposaを添加し、最初に24ウェルプレートに播種されたCFBE細胞の数に対して約30対1の感染の多重度で添加します。これは、1ミリリットルあたり0.5ミリリットルのMELで、7番目のCFUの10の1.2倍に相当します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%、空気95%で1時間よくインキュベートします。

1時間のインキュベーション後、スナットを取り外し、新しい顕微鏡と交換します。0.4%アルギニンを補充した培地。アルギニンの添加は、CFPE細胞上にバイオフィルムが形成されるのに十分な時間、単層の破壊を遅らせます。

プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%、空気95%で、数時間ごとに約8時間までのさまざまな時間でインキュベートします。顕微鏡を使用して、CFBE単分子膜の完全性とバイオフィルムの成長を分析します。フローセル共培養バイオフィルムモデルでは、直径40mmのガラスカバースリップ上にCFBE細胞のコンフルエント単層を形成する必要があります。

この最初の場所を達成するために、滅菌カバーを滅菌直径60ミリメートルのプラスチック皿に滑り込ませます。次に、3ミリリットルのプレウォームセル増殖を追加し、ピペットの先端でカバースリップを中程度に押して、下に閉じ込められた気泡を取り除き、カバースリップをプラスチックディッシュシードの底に押し込みます。皿を前後に静かに振るが、細胞が皿の側面に対して遠心分離するのを防ぐために、渦を巻かないようにする。

皿を5%二酸化炭素、95%空気インキュベーターに摂氏37度で8〜10日間置きます。細胞に1日おきに3ミリリットルの新鮮な増殖培地を給餌します。これらの条件下では、細胞はガラスカバースリップ上にコンフルエント単層を形成します。

次のステップは、実験の1日前にP好気性細菌株を調製することです。ローテーターで5ミリリットルのLBで摂氏37度で18時間pエアロゲンを成長させます。200 RPMでは、実験当日にGFPの構成的発現のためにPSM C 21プラスミドを運ぶPエアロゲン株(PO one)を使用します。

1ミリリットルの細菌培養物を滅菌マイクロ遠心チューブに入れ、6、000RPMで3分間遠心分離します。細菌ペレットを1ミリリットルの顕微鏡検査で2回洗浄します。0.5ミリリットルの洗浄および再懸濁細菌を4.5ミリリットルの顕微鏡培地に希釈して、1ミリリットルあたり8番目のCFUの10の約5倍の濃度を達成します。

これで、CFPE細胞をリアルタイムで観察する準備が整いましたが、これには、長時間の栄養素の流れを確保するために、蠕動ポンプと結合したイメージングチャンバーが必要です。温度調節器には、標準的なバイオフィルムフローセル装置を使用しています。バイオテクノロジー企業であるFCSの2チャンバーは、CFPE細胞を収容するように改造されています。

フローセル共培養バイオフィルムモデルにおける最も重要なステップの1つは、細胞モニターを損傷することなくチャンバーを組み立てることです。チャンバーの上半分を逆さまにして灌流チューブが見えるようにし、厚さ0.75mmのゴム製ガスケットのクリアランスホールを灌流チューブに合わせます。チャンバーに付属のマイクロ水道橋スライドをゴム製ガスケットの上に積み重ね、溝のある面が上になっていることを確認します。

次に、スライドの上に別のゴム製ガスケットを置きます。この2番目のガスケットの厚さと内部形状によって、チャンバーの容積が決まります。次に、スライドの中央に1ミリリットルの予温顕微鏡培地を追加します。

イメージングチャンバーを無菌面に置きながら、細胞培養インキュベーターからCFPE細胞を取り出します。使用済みの培地を皿から取り出し、CFPE細胞を3ミリリットルの予熱顕微鏡培地で一度洗浄します。エタノール洗浄鉗子を使用。

ディッシュからカバースリップを取り出し、チャンバーに置いた顕微鏡用メディウムのビーズの上に逆さまに下げます。カバースリップは2番目のゴム製ガスケットに載っており、気道細胞の単層は下を向いています。組み立てた部品を片手に持ち、チャンバーのベースをスタックの上に置き、チャンバーをすばやく裏返して、すべてが正しい向きになるようにします。

リングを回してベースを所定の位置にロックします。インレットチューブを低流量マイクロ灌流ポンプに接続します。2つ目のチューブは、ポンプを摂氏37度のウォーターバスに置かれた顕微鏡用メディウムのフラスにリンクします。

顕微鏡のすぐ隣にあります。毎時20ミリリットルの速度でフローを開始します。この流量は、ポーザの遊泳速度能力の範囲内です。

滅菌済みのプレカットされた1つの16th CFLチューブをチャンバーの入口および出口灌流チューブに取り付け、次に温度コントローラーを接続します。組み立てたチャンバーを倒立蛍光顕微鏡の顕微鏡ステージに置きます。1ミリリットルの使い捨て注射器を使用。

ポンプとチャンバーの間に一列に配置された双方向バルブを使用して、事前に準備した細菌懸濁液をチャンバーに注入し、細菌が気道細胞に付着できるようにします。ポンプを2時間停止します。2時間後、フローを再開し、毎時20ミリリットルに維持することができます。

実験の残りの部分では、差動干渉によって気道細胞の完全性を監視します。実験全体を通して造影顕微鏡法を行い、単分子膜の損傷の兆候を確認します。同時に、気道細胞の頂端表面でのGFP標識pエアロゲンバイオフィルムの発達を追跡します。

静電アッセイとフローセルアッセイの両方で倒立共焦点顕微鏡または広視野蛍光顕微鏡を使用して画像を取得することにより、CFPE単層は接種後最大8時間、変化の兆候なしにpエアロゲンの存在に耐えることができることがわかりました。上皮単分子膜の完全性は、組織培養プレート上に増殖したCFPE細胞のコンフルエント単層の例で示されるように、逆転法を用いた位相差顕微鏡法で評価することができます。時間の経過とともに、pエアロゲンは毒素と病原性因子を産生し、上皮細胞単層を完全にまたは部分的に損傷する可能性があります。

この侵害されたCFPE単分子膜の例では、緑色で示されているP好気性細菌が上皮細胞のタイトジャンクションの間に広がり、基底外側膜にアクセスしているのが見られます。バイオフィルムの形成は、通常、単分子膜が劣化するため、これらの条件下では達成されません。この画像は、バイオフィルム形成を正常にサポートした後、接種後24時間で観察された生い茂ったpエアロゲンバイオフィルムを示しています。

CFPE単分子膜は修復不可能なほど損傷しており、現在では事実上存在しません。バクテリアの平らな層として成長する残留バイオフィルムがガラスカバースリップに付着している様子が示されています。気道単層の完全性が損なわれていない場合。

Pエアロゲンバイオフィルムは、両方の共培養モデルで気道細胞の頂端表面で成功裏に形成および発達することができます。ここに示されているのは、落射蛍光顕微鏡で評価した静的共培養バイオフィルムモデルを使用して、CFPE細胞のコンフルエント単層上に成長したp好気性バイオフィルムを発現するGFPの代表的な画像です。画像は、顔のコントラストチャネルと蛍光チャネルのオーバーレイです。

この次の図は、A GFPで標識されたpエーロゲンを示しています。フロー細胞共培養バイオフィルムモデルを使用して、CFBE細胞のコンフルエント単層上でバイオフィルムを6時間増殖させ、気道の可視化を容易にします。単層核は、ポサを接種する前にHEXT3 33 42で染色され、青色に見えます。

CFPE細胞の頂端表面に付着した緑色の塊として現れるフィルムは、気道細胞全体に分散しています。ここでは、3D再構成後にA-C-F-P-E細胞単層上に形成される6時間前のエアロゲンバイオフィルムの典型的なキノコ様構造を示しています。このビデオを見れば、ここで説明する共培養モデルを使用し、標準的な微生物学的手法や蛍光顕微鏡法と組み合わせて、確立された気道細胞の単層上で細菌バイオフィルムを成長させ、可視化する方法を十分に理解できるはずです。