ブリオスタチンの1/Ionomycinによる腫瘍反応性T細胞のex vivoでの拡張と共通γ鎖のサイトカインの策定

この実験の目標は、ブリオススタチン1イオンマイシンによるT細胞の活性化を誘導すること、およびガンマ鎖サイトカインによるT細胞の分化は、脾臓およびリンパ節からの腫瘍感作性T細胞の単離から始まることです。次に、ブリオススタチン1とイオンマイシン2で細胞内シグナル模倣物を活性化し、それぞれプロテインキナーゼC活性と細胞内カルシウムを増加させます。IL 7、IL 15、およびIL 2の存在下で培養し、腫瘍反応性T細胞の分化および増殖を行います。

インターフェロンガンマEISAの結果と細胞毒性アッセイの強力な組み合わせにより、拡大したT細胞の腫瘍反応性に光を当て、養子免疫療法に潜在的な洞察を提供することができます。腫瘍反応性T細胞のexvivo増殖のこの方法は、腫瘍反応性T細胞の分化における一般的なガンマイメージングサイトカインの役割は何かなど、腫瘍免疫学における重要な質問に答えるのに役立ちます。また、エフェクター細胞、エフェクターメモリー細胞、中枢記憶細胞などの各T細胞表現型は、がんに対する長期記憶応答を生成する上でどのような役割を果たしているのでしょうか。

リンパ節と脾臓の絶縁、およびリンパ球の敗血症性の取り扱いは、実施するのが難しい手順ですが、迅速に習得できます。観察によって。FVBN 2 0 2トランスジェニック雌マウスは、MMTVプロモーターの調節下で不活化ラットの新しい導入遺伝子を発現し、その結果、生後4か月から10か月の間に自然発生的な乳腺癌を発症しました。

このプロトコルでは、これらの自発的な腫瘍担体マウスを腫瘍反応性T細胞のドナーとして使用します。まず、腫瘍発生性FVBN 2 0 2トランスジェニックマウスから腫瘍ドレインリンパ節と脾臓を分離します。今度は、1マイクロモルのシン5ナノモルブリオススタチン1とミリリットルあたり80ユニットで15%FBSを含む完全な培地で10から10ミリメートルリットルあたり6細胞に10%FB sce Aの培養を添加した氷冷RPMI 1640で単一細胞懸濁液を準備します。

37°Cで平衡化したPMI培地で16時間ILを2回行い、細胞を3回洗浄した後、10〜6細胞/ミリリットルで10ナノグラム/ミリリットルの完全な培地で、IL7とIL15をそれぞれ24時間培養します。細胞をさらに活性化するために、ミリリットルILあたり40単位を24時間追加してパルスをパルスします。次に、細胞を分割し、1ミリリットルあたり10ナノグラムで培養し、必要に応じてIL7とIL15をそれぞれさらに4日間培養し、培地を交換して2日ごとに細胞を分割します。

増殖した初代T細胞を遠心分離により回収し、光学顕微鏡で細胞を列挙し、T細胞の倍増を計算します。次に、フローサイトメトリー用の細胞を調製して、CD陽性T細胞8個および陽性T細胞CD4個の割合を決定します。まず、抗CD16、CD32抗体と細胞を氷上で20分間インキュベートすることにより、FC受容体への抗体の非特異的結合をブロックします。

次に、1%アジ化ナトリウムを添加した2ミリリットルの氷冷PBSで細胞を2回洗浄し、Fitz CD 4およびPE CD 8抗体と氷上で20分間インキュベートして細胞を染色します。1%FBSと0.1%アジ化ナトリウムを添加した2ミリリットルの氷冷PBSで2回洗浄します。最後に、細胞を1%パラホルムアルデヒドで固定し、6つのウェル培養プレートでsummitバージョン4.3ソフトウェアを使用してベックマン・コールターFC 500でサンプルを分析し、乳腺腫瘍細胞を含むT細胞を10対1のエフェクター対ターゲット比でピペットで、ウェルあたり3ミリリットル

IL2のミリリットルあたり20単位を含む完全な培地は、摂氏37度と5%二酸化炭素で48時間インキュベートします。新しい陽性腫瘍細胞の製造元のプロトコルゲートの事実に従って、新しいPE抗US IgGおよびXin five fiteおよびヨウ化プロピジウムに続いて3色抗体染色を行い、Xin five piで腫瘍細胞の生存率を分析します。BI による T 細胞の活性化を 16 時間行うと、in vivo で腫瘍に感作されていないナイーブ T 細胞が死滅します。

腫瘍反応性T細胞の二選択性の後、ガンマ鎖サイトカインを用いて6日間の培養で最大2.8倍に拡大し、CD8陽性T細胞およびCD4陽性T細胞の両方がガンマ鎖サイトカインと共に等しく増殖する。6日間のex vivo培養後、ex vivoで増殖したT細胞は、インターフェロンガンマの産生によって評価されたように、ドナーマウスが感作された腫瘍に対して高い応答性を示す。新しい陽性マウス乳腺がんまたはMMC腫瘍細胞の存在下では、ex vivoで増殖したT細胞は、新しい陽性MMC腫瘍細胞にアポトーシスを誘導することができ、腫瘍細胞の生存率が48時間以内に92%から61%に低下します。

この手順を試行する際は、無菌条件下で作業することを忘れないでください。このビデオを見た後、がんの適応T細胞療法のために腫瘍活性T細胞を選択および拡大する方法を十分に理解しているはずです。