幹細胞由来の神経前駆細胞のヒト皮質スライスへの移植

皮質ニューロンへの分化のために準備された幹細胞由来のニューロン前駆細胞の接着培養から始めます。

培地を取り除き、酵素を加えて細胞外マトリックスを破壊し、細胞を剥離します。

阻害剤を使用して酵素を中和し、新鮮な培地を追加します。

懸濁液をチューブに移し、遠心分離し、上清を廃棄して細胞を分離します。

細胞を基底膜マトリックスに再懸濁して脳組織への移植を容易にし、冷たい毛細血管にロードします。

ヒト皮質スライスを培地を含むトランスウェルアセンブリに取り出します。

培地の一部を取り除き、細胞懸濁液の液滴を組織に注入します。

マトリックスが固化するまでインキュベートします。

培地を加えて組織を浸漬し、インキュベートして前駆細胞がニューロンに分化し、神経突起を伸ばし、宿主皮質ニューロンとシナプスを形成できるようにします。

で、皮質スライスを分析する準備が整いました。

細胞培養フラスコから培地を取り出します。分化の7日目に、500マイクロリットルのトリプシンを添加して皮質的にプライミングしたGFP-lt-NES細胞を分離し、室温で5〜10分間インキュベートします。

次に、等量のトリプシン阻害剤を加え、続いて5ミリリットルのDDM培地を加えます。細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに穏やかに移し、300Gで5分間遠心分離します。その間、ヒト組織を含むプレートをインキュベーターからフードに移し、インサートの上部から2ミリリットルの培地を取り出します。遠心分離の最後に、上清を除去し、細胞を冷たく純粋な基底膜マトリックスに再懸濁し、懸濁液をより小さなチューブに移します。

細胞懸濁液を、吸引のためにゴム製の乳頭に接続された冷たいガラス毛細管に集めます。半乾燥組織スライスをさまざまな部位に刺すことにより、細胞懸濁液を小さな滴として注入します。ゲルを摂氏37度で30分間固化させます。

次に、プレートをインキュベーターからフードに戻し、2ミリリットルのヒト成人皮質培地をインサートの上部に注意深く加えて、組織を完全に沈めます。