のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

ショウジョウバエの胸部筋のパラフィン包埋切片および凍結切片を調製するための以下の組織学的手法は、筋肉の形態およびタンパク質発現の解析に強力なアプローチを可能にします。これは、最初に動物を首輪に固定し、次に組織を埋め込むことによって達成されます。パラフィンまたはOCT培地では、埋め込まれたoph thaxはミクロトームによって切片化されます。

最後に、切片を染色して筋肉組織の構造を視覚化したり、筋肉のさまざまな分子成分を検出したりします。得られた標本を従来の組織学的染色法、蛍光色素、または免疫染色と組み合わせて使用すると、筋肉組織の形態と筋肉特異的成分の局在を示すことができます。この技術の主な利点は、動物内で自然に見られる構成で細い筋嚢を回収する能力です。

この方法は、ショウジョウバエヘッダー腹部などの他のシステムに容易に適応できます。これは、遺伝子発現とシグナル伝達の研究室であるHelena Shetaの研究室で開発され、本日はMaria Rinkoによってデモンストレーションされます。最初に、カラーをガラス製のステンジャーに沈めるためのすべてのソリューションを保管してください。

無水エタノールクロロホルムと氷酢酸をそれぞれ6対3対1の割合で組み合わせて、新しい車の騒音固定剤を準備します。アルミホイルのスタック、襟に適したサイズのポケットを作成します。また、エタノール溶液、メチル化溶液、パラフィン溶液を染色ジャーで調製します。

次に、安息香酸メチルとパラフィンの容器を摂氏60〜65度に設定されたインキュベーターに入れます。さらに、より多くのパラフィンを摂氏60〜65度に温めます。ホイルポケットに注ぐには、フライのエントリーポイントが見えるように、顕微鏡下のテープを使用して垂直位置にカラーを取り付けます。

ハエに麻酔をかけるには、二酸化炭素を使用するか、氷の塊を使用して低体温療法を行います。鉗子を使用してハエを凍らせないように注意してください。翼で個々のハエを拾い上げ、各ハエを首輪の向きに配置して、頭と胸部がブレードの上にくるようにし、腹部がブレードの下にくるようにします。

複数の遺伝子型を分析するときは、各首輪に10〜20匹のハエを配置します。カラー番号と対応する遺伝子型に注意してください。カラーをCarnoy溶液に移し、組織を摂氏4度で一晩固定します。

固定後、カラーを高濃度のエタノール浴に室温でそれぞれ10分間浸漬して、サンプルを脱水します。次に、カラーを安息香酸メチルおよび安息香酸メチルとパラフィン溶液でそれぞれ30分間インキュベートし、次いでパラフィンの2つの交換にカラーをそれぞれ60分間浸潤させる。摂氏60度から65度で、襟をホイルポケットに素早く移します。

この時点で、首輪をホイルポケットに配置して、縦方向または横方向のセクションの植物の向きを容易にする必要があります。次に、パラフィンが固まるように、ポケットに溶かしたパラフィンを入れます。ホイルポケットを室温で一晩放置します。

ドライパラフィンブロックをホイルのカラーで包み、後で鋭利なメスを使用してカラーをパラフィンブロックからそっと分離します。回転ミクロトーム上のフライ組織の周りから余分なパラフィンを慎重に切り出します。パラフィンブロックを7〜10ミクロンのセクションステップでカットします。

カットティッシュを摂氏30度の水浴で平らに浮かべます。最後に、切片組織を極性スライドに置き、一晩乾燥させます。これらのスライドは、ヘマチンとエオシンで染色する準備が整いました。

実験開始の1時間前に、クライオ埋め込み培地のボトルを逆さまにして摂氏4度の冷蔵庫に入れ、冷却して気泡の形成を最小限に抑えます。さらに、エタノールとドライアイスの助けを借りて、摂氏マイナス60度の冷凍クーラーを設置します。パラフィン切片と同様に、ハエを首輪に固定し、ハエのついた首輪を予冷箔ポケットに移し、クライオ包埋化合物をOCTで急速に充填します。

OCTをしっかりとさせましょう。形成されたブロックをクーラーの内側で慎重に広げます。カラーを埋め込みブロックからそっと分離し、マイナス20°Cでクライオミクロトームに少なくとも1日置き、マイナス15°Cからマイナス18°Cの間の凍結した筋肉を10〜15ミクロンの切片の厚さで切断します。

次に、偏光スライドにサンプルを置きます。サンプルは、さらなる処理の準備ができるまで、摂氏マイナス20度で保管します。脂質ドロップアウトは、クライオ切片のオイルレッドまたはステインで検出できます。

seber and tumから採用されたプロトコルを使用して、染色の直前に、凍結切片を固定後10分間4%ホルムアルデヒドで固定する必要があることを忘れないでください。スライドを水で2回、それぞれ5分間洗います。次に、プロピレングリコールで10分間平衡化します。

次に、オイルで3時間インキュベートします。室温で赤o染色します。次に、サンプルをポリプロピレングリコールで5分間2回洗浄し、続いてPBSマウントサンプルを30%グリセロール、ヘマチン、およびエオシンで30分間洗浄すると、間接飛行筋の縦方向の断面で横方向のサンプルが、異常なサイズと形態を正常な構造の筋肉と区別します。

パラフィン包埋切片は、核膜マーカーに照らされたショウジョウバエ腸管のこの部分に示されているように、抗体で効果的に染色することもできます。ラミンCと核染色dpi。ここでは、ショウジョウバエのタックスの横断面を抗ラムCとDPIで染色し、正常な筋肉と劣化した筋肉を拡大して表示します。

同様に、間接飛行筋の縦方向の凍結切片は、ショウジョウバエ胸部ラベルの油性O横凍結切片で染色すると、抗分散筋、糖鎖筋、サルコレンママーカー、およびDPIで染色できます。これらの技術をHNE染色や免疫組織化学検出などの他の方法と組み合わせることで、筋肉の組織構造とタンパク質の局在を決定するための強力なアプローチが提供されます。