Sf9細胞でとアメフラシ感覚ニューロンにおけるPKC転座のライブイメージング

このビデオでは、我々は、蛍光標識のPKCS使用して生きた細胞内PKC転座の可視化を実証する。

この手順の目的は、生細胞内の蛍光タグ付きPKC転座を視覚化することです。これは、最初にSFナイン細胞培養物またはPlegia Californiaからの感覚ニューロンの培養物を調製することによって達成されます。2番目のステップは、蛍光タグ付きpkcを細胞内で発現させることです。

最後のステップは、レーザー走査型顕微鏡を使用して、さまざまなアクチベーターに応答したPKC転座を画像化することです。最終的には、生細胞を使用してPKC転座をリアルタイムでイメージングすることにより、ジオールグリセロールなどのセカンドメッセンジャーによるさまざまなPKCアイソフォームの異なる制御を示す結果を得ることができます。こんにちは、私の名前はキャロル・フェラです。

私はモントリオール神経学研究所のウェイン・ソーン博士研究室の研究員です。今日は、Aplysia感覚ニューロンにおけるPKC転座のライブイメージングをデモンストレーションします。この方法は、記憶形成中にさまざまなPKCアイソフォームがどのように活性化されるかなど、シナプス可塑性分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

組織培養フード内でSFナイン細胞単層培養物を調製するには、30%ウシ胎児血清を含む8ミリリットルのグレースの昆虫培地を75センチメートル四方の細胞培養フラスコに投入し、次いでSFナイン細胞の凍結チューブを37°Cの水浴中でチューブを前後に約1〜2分間急速に解凍する。次に、SFナイン細胞を細胞培養フラスコに移し、フラスコを手で優しく揺らして細胞を均一に分散させます。細胞が付着するまで、摂氏27度で1〜2時間インキュベートします。

次に、フラスコから古い培地を取り出し、さらに10ミリリットルの新鮮な恵み昆虫培地と交換します:30%FBSを含む昆虫培地、細胞が共生するまで摂氏27度で細胞をインキュベートします。単層培養を維持するために、SF nine細胞のコンフルエントフラスコから古い培地を取り出し、10%FBSを含む5ミリリットルのgraceの昆虫培地を10mL加え、フラスコの側面を数回軽くたたいてSFナイン細胞を剥離します。次に、10ミリリットルのピペットを使用して、メディアを静かに上下にピペットで動かします。

ピペッティングしながらフラスコ壁にスプリッツした後、細胞を滅菌済みの15ミリリットルポリスチレンチューブに移します。10%FBSを含む8ミリリットルのgraceの昆虫培地に2ミリリットルのSF9細胞懸濁液を添加し、希釈比が1〜5の新しい75センチメートル四方の細胞培養フラスコに入れます。対数相の成長を維持するために、フラスコを手で優しく揺らします。

次に、細胞が共流暢になるまで、細胞を摂氏27度で再度インキュベートします。インキュベーション後、SFナイン細胞は、蛍光タグ付きpkcsの発現に先立つ書面による手順に記載されているように、蛍光タグ付きpkcsの発現に使用する準備ができています。感覚ニューロンの分離の2日後、シリンジと0.2ミクロンの細孔サイズの20ミリメートルシリンジフィルターを使用して、事前に準備したファストグリーンのクォ

0.5%fast greenを含む蒸留水にE-G-F-P-P KC API 2をコードするプラスミドDNAの溶液を調製し、1マイクロリットルあたり0.4マイクログラム以下の濃度で調製します。1ミリリットルのシリンジと孔径0.2ミクロンの4ミリシリンジフィルターを使用して、プラスミドDNAファストグリーン溶液をろ過します。次に、プラスミドDNAの高速グリーン溶液と16,110Gをマイクロ遠心分離機を使用して15分間遠心分離します。

次に、マイクロ電極プーラーを使用してニューロンのマイクロインジェクション用の鋭利な電極を準備します。内部にフィラメントが入った薄肉ガラスキャピラリーを使用して、ガラス微小電極を引っ張ります。各電極に2マイクロリットルのプラスミドDNAファストグリーン溶液を充填します。

マイクロロードピペットチップを使用して、マイクロインジェクションステーションでマイクロインジェクションを行います。マイクロインジェクションステーションは、防振テーブルの上に培養皿を保持するための自家製の大きなガラスステージで構成されています。外部ハロゲン照明を備えたステレオスコープ、マイクロマニピュレーター、空気圧ポンプに接続されたマイクロ電極ホルダー。

空気圧ポンプの圧力入力は、圧縮窒素タンクに接続されています。プレジアニューロン培養物が入ったマテックガラス底培養皿をマイクロ注入ステーションに移し、マイクロ電極ホルダーにマイクロ電極を挿入します。実体顕微鏡でニューロンを観察し、マイクロピペットの先端を細胞核に挿入します。

核が均一に緑色になるまで、持続時間10〜100ミリ秒、平方インチあたり20ポンドの窒素の短い圧力パルスを送達します。細胞を室温で4時間インキュベートし、軸回避機能を備えたZeiss LSM five 10倒立共焦点顕微鏡を使用するまで摂氏4度に保ちます。200は、SFナイン細胞と麻痺感覚ニューロンの両方のイメージングに使用されます。

このビデオでは、麻痺感覚ニューロンのイメージングが実証されています。SFナイン細胞のイメージングに関する詳細は、書面によるプロトコールに記載されています。50%レーザー出力の30ミリワットのアルゴンレーザーを使用して、EGFPタンパク質でタグ付けされたPKCを画像化します。

次に、アルゴンヌレーザーラインを4%の透過出力に減衰させます。次に、ピンホールを1つに調整し、イメージングステージで培養皿を安定させ、動きや振動を避けます。10ミリリットルのピペットを使用して皿から1ミリリットルの培地を静かに取り出し、総容量1ミリリットルを残します。

お皿に。核が見える細胞の中央部分を見つけます。10〜20枚の共焦点画像の時系列を30秒の時間間隔で設定します。

動画を開始し、2枚目の写真を撮った後、1ミリリットルの薬物を2倍の濃度で穏やかに加え、転座を誘導します。細胞の上に薬物を一滴ずつ連続して約30秒間加えます。ここでは、セロトニンを使用して高速転座を誘導し、薬物治療の直後に見ることができます。

一部の薬物は、治療後5〜10分で最適なゆっくりとした転座を誘発し、2つの10ミリリットルピペットで薬物を洗い流し、皿の片側に1つのピペットで洗浄バッファーを優しくピペッティングし、反対側に培地をピペッティングします。洗浄が効果的で、薬物の効果が可逆的である場合、PKCは30〜60秒以内にサイトゾルに戻ります。.ムービーを図のLSMファイルとして保存します。

これは、麻痺感覚ニューロンにおけるPKC転座のライブイメージングの代表的な結果です。E-G-F-P-P KC APL 2を感覚ニューロンで発現し、一連の10枚の共焦点画像を30秒の時間間隔で記録しました。この例では、30秒の録音後にセロトニンが皿に追加されました。

この例では、PKC転座のライブイメージングがSFナインセルで示されています。E-G-F-P-P KC APL oneとM-R-F-P-P KC APL 2を共発現させた SFでは9つの細胞と一連の10の共焦点画像を30秒の時間間隔で記録した。1つ2つのジオクチルSNグリセロール。

DILグリセロールの細胞透過性アナログを、30秒間の記録後に皿に添加しました。このビデオを見れば、無形成感覚ニューロンで蛍光タグ付きpkcを発現する方法や、生細胞でPKC転座を画像化する方法についてよく理解できるはずです。