癌細胞による内皮細胞単層の侵入を測定するリアルタイム電気インピーダンス基づく手法

この動画では、リアルタイム電気インピーダンス法を用いて、がん細胞による血管内皮細胞単層への浸潤をモニタリングする方法を実演します。まず、VEと称されるヒト臍帯静脈内皮細胞を、ウェル底部に金電極がコーティングされた16ウェルEPLに播種します。合流単層を形成させるためにがん細胞を添加すると、がん細胞がVEに付着して内皮細胞単層に浸潤し、内皮細胞間の接合を破壊します。その後、細胞によって覆われたウェル底部の総面積に依存するインピーダンス値を測定します。

その後、電気インピーダンスの変化に基づいて浸潤の程度を決定できます。この手法、あるいは空隙チャンバー法やMETROGELアッセイなどの既存の手法の主な利点は、血管内皮細胞と腫瘍細胞の相互作用がin vivoの転移プロセスをより忠実に模倣している点であり、また、他の手法のようなエンドポイント解析とは異なり、データがリアルタイムで得られ、より定量化が容易である点にあります。この方法は、がん細胞の浸潤に関する知見を提供することが可能です。

また、本手法は免疫系における細胞間相互作用の調査など、他の系にも適用可能です。さらに、UX細胞の増殖を観察する実験の初期段階は、その後の浸潤ステップを経ることなく、あらゆる細胞株の細胞増殖能を評価するために利用でき、本手順の有用性が示されています。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるsite Rahimが行います。本プロトコルのすべてのステップは、組織培養フード内の無菌条件下で実施してください。

本実験で使用するXcelシステムは、初回使用時はこの装置専用の37°C、5% CO₂インキュベーター内に常時保管してください。新しい温度および湿度環境に慣らすため、装置をインキュベーター内に少なくとも16時間静置する必要があります。次に、Thence EPL 16を0.1%ゼラチンで37°Cで1時間コーティングし、準備します。

プレートにコーティングした後、PBSで1回洗浄します。次に、ブランク測定を行うために、再構成したe gm two mediumを100 µL加えます。これにより、細胞が存在しない状態での背景インピーダンスを測定します。

EPLをコンピュータ上のExcelエージェントシステムにセットします。ソフトウェアウィンドウ内のデスクトップにあるRTCAソフトウェアアイコンをクリックして、Excelエージェントソフトウェアを開きます。レイアウトタブをクリックし、サンプルが入っているウェルを選択します。

リアルタイムデータ収集の頻度を設定するには、「schedule」タブをクリックし、「add a step」アイコンをクリックします。「sweeps」は読み取り回数を、「intervals」は読み取りの間隔時間を表します。これらはそれぞれ、デフォルトで1および1.00分に設定されています。

これにより、システムでバックグラウンド測定を行うよう設定します。「ステップの追加」をクリックし、「スイープ数」のボックスに300を、「間隔」のボックスに10分を入力します。これで、最大50時間にわたってインピーダンス測定を行うよう装置がプログラムされます。

実験を開始するには、「ステップ開始」アイコンをクリックします。バックグラウンド測定の完了後、各ウェルのバックグラウンドインピーダンスが測定されます。ウィンドウにメッセージが表示されます。

次のステップに進む場合は、クリックしてください。次のステップを開始します。ここで、前述の手順に従って細胞を添加し、単層の形成を観察することができます。

次のセクションでは、ここで使用するヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、成長因子サプリメントを含むEGM-2 Bullet Kitで調製したEGM-2培地および5% FBSを用いて培養します。細胞は、37 °C、5% CO2のインキュベーター内で維持してください。実験当日、顕微鏡下でHUVECのコンフルエンシーを確認します。細胞は低継代数（好ましくは6回以下）であり、単層を形成させるためにコンフルエンシーが75%未満である必要があります。トリプシンを用いて細胞を回収します。細胞がフラスコから剥がれたら、200 ×gでの遠心分離によりトリプシンの痕跡をすべて除去してください。遠心分離後、PBSで一度細胞を洗浄します。

次に、細胞と再構成したEGM-2培地を、濃度が2.5 × 10⁵ cells/mLになるように再懸濁します。細胞の再懸濁が完了したら、EXOGENシステムからバックグラウンド校正済みのEPLを取り出し、プレート内の100 µLのEGM-2培地に、100 µLの細胞懸濁液を加えます。直ちにEPLをExcelシステムセルアナライザーに設置してください。

ソフトウェアウィンドウのスタートステップボタンをクリックして、インピーダンス値の測定を開始します。血管内皮細胞を増殖させます。システムは10分ごとにインピーダンス値の測定を継続します。

Uve細胞は、播種後4〜6時間に細胞インデックスが特徴的に一時的に平坦化し、その後16〜18時間後に再び安定します。したがって、細胞がコンフルエントな単層を形成するまで、少なくとも18時間は待機することが重要です。単層が形成されたら、浸潤アッセイの準備として浸潤細胞を添加します。

浸潤腫瘍細胞を準備します。ここでは骨肉腫細胞を使用します。まず、トリプシンを用いて細胞を回収します。

細胞を 200 G で遠心分離し、PPSで一度洗浄して、トリプシンの痕跡をすべて除去します。洗浄後、腫瘍細胞の培養に使用した培地（10% FBS 含有 RPMI または DMEM 培地など）を用いて、最終細胞密度が 1 × 10⁵ cells/mL となるように細胞を懸濁させます。ソフトウェアウィンドウの一時停止ステップアイコンをクリックし、実験を一時停止してください。

EPLを除去し、vacモノレイヤーからEGM two培地を吸引します。1×10⁴個の細胞を含む腫瘍細胞懸濁液を100 µL添加します。一般的に、このアッセイでは腫瘍細胞と血管内皮細胞の比率を1:2.5にすることが最適です。

ただし、この比率は個々の細胞株に合わせて最適化することが可能です。EPLをインキュベーター内のExcel agentシステムに戻します。「continue」ステップをクリックし、10分間隔でインピーダンス測定を継続します。

その後6～12時間にわたり、浸潤をリアルタイムでモニタリングします。内皮細胞接合部の収縮と浸潤腫瘍細胞の貫通により、セルインデックス（cell index）が低下します。実験終了後、exergenソフトウェアを使用して、浸潤腫瘍細胞を添加した時点に結果を正規化します。

exergenソフトウェアでは、このビデオで示されているように、exergenシステムでVEXを培養した任意の時点に正規化することが可能です。また、単層形成後にK7M2細胞またはK12細胞を添加しました。ここで示されているように、K7M2細胞の導入後数時間以内にセルインデックスの急激な低下が起こります。K7M2は極めて転移性の高い骨肉腫細胞株です。

これらの細胞は、細胞骨格リンカータンパク質であるeneを高レベルで発現しており、それがこの細胞株の浸潤性に寄与しています。一方、K 12細胞は転移能が低く、K seven M two細胞ほど効率的に内皮細胞単層を貫通することができません。これは、ここに示されているように、細胞インデックスの減少幅が小さいことで表されています。

ここに示されているコントロールは、脈絡膜内皮細胞単層のインピーダンスを表しています。がん細胞が存在しない状態で、実験を3回繰り返し行いました。このビデオを視聴することで、内皮細胞単層を形成し、そこにがん細胞を添加することで、浸潤をリアルタイムで測定する方法を十分に理解できるはずです。

HU XL単層形成を含む実験の初期段階は、インピーダンスによる細胞増殖の評価に使用できます。2。