癌細胞による内皮細胞単層の侵入を測定するリアルタイム電気インピーダンス基づく手法

この記事では説明し

このビデオでは、リアルタイムの電気インピーダンスベースの手法を使用して、がん細胞による内皮細胞単層への浸潤を監視する方法を示します。まず、VEと呼ばれるヒト臍帯静脈内皮細胞は、ウェル底部に金電極でコーティングされた16ウェルEPLに装着されます。コンフルエント単層を産生するためには、がん細胞が添加され、これがVEに付着してHVAC単層に侵入し、内皮細胞接合部を破壊する細胞によって覆われたウェルボトムの全面積に依存するインピーダンス測定値が取得される。

その後、侵入の程度は、電気インピーダンスの変化に基づいて決定できます。この手法や、void chamberやMETROGELアッセイなどの既存の方法の主な利点は、内皮細胞腫瘍細胞の相互作用がin vivo転移プロセスにより密接に模倣され、データがリアルタイムで取得され、他の方法のエンドポイント分析とは対照的に、より簡単に定量化できることです。しかし、この方法は癌細胞の浸潤についての洞察を提供することができます。

また、免疫系における細胞細胞相互作用の研究など、他のシステムにも適用できます。さらに、UX細胞の成長を観察する実験の初期段階は、追加の侵入ステップなしで任意の細胞株の細胞増殖を評価するために使用できます。このプロトコールのすべてのステップは、組織培養フード内の滅菌条件下で実行する必要があります。

この実験に使用したXcelシステムは、摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターに恒久的に保管されており、最初の使用時にはこの装置専用です。機器は、新しい温度と湿度の環境に平衡化するために、少なくとも16時間インキュベーターに放置する必要があります。次に、摂氏37度で0.1%ゼラチンで1時間コーティングすることにより、EPL 16を準備します。

プレートがコーティングされたら、PBSで一度洗います。次に、100マイクロリットルの再構成されたe gm two mediumを追加して、ブランク読み取りを行います。セルがない場合のバックグラウンドインピーダンスを測定するため。

EPL をコンピューター上の Excel エージェント システムに配置します。ソフトウェアウィンドウのデスクトップにあるRTCAソフトウェアアイコンをクリックして、Excelエージェントソフトウェアを開きます。レイアウトタブをクリックし、サンプルを含むウェルを選択します。

リアルタイムデータ取得の頻度をプログラムします。[スケジュール]タブをクリックし、[ステップの追加]アイコンをクリックすると、sweepsは読み取りの数を示し、intervalは読み取り間の時間間隔を示します。これらは、それぞれ 1 分と 1.00 分に自動的に設定されます。

これにより、バックグラウンド読み取りを実行するようにシステムがプログラムされます。[ステップの追加]をクリックし、スイープボックスに300を、間隔ボックスに10分を入力します。これにより、最大50時間のインピーダンス測定を実行するように機器がプログラムされます。

実験を開始するには、ステップの開始アイコンをクリックします。各ウェルのバックグラウンドインピーダンスは、バックグラウンド測定が行われた後に測定されます。ウィンドウにメッセージが表示されます。

次のステップの準備ができました、をクリックしてください。開始する次のステップ。このとき、細胞を添加し、説明したように単層の形成を監視できます。

次のセクションでは、ここで使用したヒト臍帯静脈、内皮細胞、またはVEを、成長因子サプリメントを含むEGM Two Bulletキットで再構成したEGM 2培地で培養し、5%FBS細胞を5%二酸化炭素の存在下で摂氏37度のインキュベーターに維持する必要があります。実験の日に、顕微鏡下でHUB Eの共流暢さを確認し、細胞は低い継代数、好ましくは6以下、75%未満であるべきであり、色相を生成するために、単層はトリプシンによって細胞を収穫する。細胞がフラスコから分離したら、トリプシンのすべての痕跡を200 Gの遠心分離によって除去する必要があります。

次いで、細胞を再懸濁し、eGMの2つの培地を10〜5細胞当たり5番目の細胞の2.5倍の濃度に再構成した。細胞が再懸濁されたら、バックグラウンドキャリブレーションされたEPLをEXOGENシステムから取り出し、プレートにすでにあるE GM 2培地の100マイクロリットルにHX懸濁液100マイクロリットルを追加します。すぐにEPLをExcelシステムセルアナライザーに入れます。

インピーダンス測定値の取込みを開始するには、ソフトウェア・ウィンドウの「スタート・ステップ」ボタンをクリックします。内皮細胞を成長させます。システムは、10分ごとにインピーダンスの読み取りを続けます。

Uveは、播種後4〜6時間で細胞指数の特徴的な一過性平坦化を示し、続いて16〜18時間後に別の安定化を示します。したがって、細胞を少なくとも18時間コンフルエント単層形成させることが重要です。単層が形成されたら、インベージョンアッセイの準備として侵入細胞を追加します。

浸潤する腫瘍細胞を準備します。ここでは骨肉腫細胞が使用されます。トリプシンで細胞を回収することから始めます。

細胞を200Gで回転させ、PPSで一度洗浄することにより、トリプシンの痕跡をすべて除去します。洗浄後、10%FBSを含有するRPMI培地やDMEA培地などの腫瘍細胞の増殖に用いた培地で、最終密度が10〜5細胞/ミリリットルの1倍で細胞を懸濁します。実験を一時停止するには、ソフトウェア ウィンドウの一時停止ステップ アイコンをクリックします。

EPLを取り外し、VAC単層からEGM 2つの媒体を吸引します。1×10を含む腫瘍細胞懸濁液100マイクロリットルを第4の細胞に加える。一般に、腫瘍細胞と内皮細胞の比率は1〜2.5のアッセイに最適です。

ただし、この比率は個々の細胞株に対して最適化できます。EPLをインキュベーターのExcelエージェントシステムに戻します。[Continue]ステップをクリックすると、10分間隔でインピーダンスの読み取りが続行されます。

今後6時間から12時間にわたって、侵攻をリアルタイムで監視します。細胞指数の低下は、内皮接合部の収縮と腫瘍細胞への浸潤による浸透から生じます。実験が終了したら、exergenソフトウェアを使用して、浸潤した腫瘍細胞の添加時間に結果を正規化します。

エクセルゲンソフトウェアは、このビデオに示すように、エクセルゲンシステム上でVEXを培養し、単層の形成後にK 7 M two細胞またはK 12細胞を添加した任意の時点への正規化を可能にします。ここに示すように、K 7 M two細胞の導入後数時間以内に細胞指数の急激な低下が起こります。K seven M twoは、高度に転移性を有する骨肉腫細胞株です。

これらの細胞は、細胞株の侵襲性を説明する細胞骨格リンカータンパク質eneを高レベルで発現します。一方、K 12細胞は転移性が低く、K 7 M two細胞ほど効率的に内皮単層に浸透できません。これは、ここに示すように、セルインデックスの減少がそれほど深くないことで表されます。

ここに示す制御は、uve単層のインピーダンスを表しています。がん細胞がない場合、実験は3回に分けて行いました。このビデオを見た後、内皮細胞単層を生成し、その単層にがん細胞を挑戦することにより、浸潤をリアルタイムで測定する方法を十分に理解しているはずです。

HU XL単分子膜形成を含む実験の最初のステップは、インピーダンスによる細胞増殖を評価するために使用できます。2。