グリコーゲン分岐の程度を測定するためのグリコーゲン分岐アッセイ

グリコーゲンなどの分岐多糖類は、α-1,4-グリコシド結合を介して直線的に結合し、α-1,6-グリコシド結合を介して分岐したグルコース残基で構成されています。

多糖類の分岐の程度を決定するには、ヨウ化カリウム、ヨウ素、塩化カルシウムを含む水性着色試薬から始めます。水性条件下では、ヨウ化カリウムとヨウ素はヨウ化物イオンを生成します。

別々の微量遠心チューブで、試薬を既知の分岐構造の多糖類および特徴付けされていない構造のグリコーゲンサンプルと混合します。

多糖類は、α-1,4-グリコシド結合を介してらせん構造を採用します。ヨウ化物イオンはこのらせん状のコアに結合し、線状のポリヨウ化物鎖を形成します。これにより、多糖類とポリヨウ化物鎖の間に電荷移動複合体が形成され、着色された多糖類-ヨウ化物複合体が生じます。

ポリヨウ化物鎖が長い非分岐多糖類は青色を呈しますが、ポリヨウ化物鎖が短い分岐多糖類は黄色がかったオレンジ茶色の複合体を発達させます。試薬中の塩化カルシウムは複雑な色を強めます。

混合物を使い捨てキュベットに移します。分光光度計を使用して、330〜800ナノメートルの吸光度スペクトルを測定します。

青色の分岐していない錯体は、より長い波長の光を吸収し、吸光度の最大値が右にシフトすることを示しています。対照的に、分岐錯体はより短い波長の光を吸収し、吸光度の最大値が左にシフトすると、構造内の分岐が大きいことを示します。

約450ナノメートルでの未特徴のグリコーゲンサンプルの吸光度最大値は、その分岐構造を確認します。

グリコーゲンの分岐を決定するには、650マイクロリットルのヨウ素/塩化カルシウム着色試薬ストックと100マイクロリットルの水を1.5ミリリットルのチューブに入れ、溶液を完全に混合してから使い捨てのメタクリレートキュベットに移します。キュベットを分光光度計に入れて、330〜800ナノメートルのバックグラウンドスペクトルを収集するための波長スキャンモードで実行します。

別の1.5ミリリットルのチューブで、650マイクロリットルの作業ヨウ素/塩化カルシウム着色試薬と50マイクログラムのカキグリコーゲンを混ぜ合わせ、最終容量を水で750マイクロリットルにします。混合物を完全にブレンドした後、溶液を使い捨てのメタクリレートキュベットに移して、330〜800ナノメートルの吸収スペクトルを収集します。

同様に、前述のように、50マイクログラムのアミロペクチンと30マイクログラムのアミロースを含む吸収スペクトルを得る。

特徴付けされていないグリコーゲンサンプルの分岐構造の指標を得るには、25〜50マイクログラムのグリコーゲンを650マイクロリットルの作業ヨウ素/塩化カルシウムカラー試薬と組み合わせ、前述のように進行して吸収スペクトルを取得します。