植物性エストロゲン活性をスクリーニングするためのエストロゲン受容体-レポーター活性アッセイ

エストロゲンは、内分泌シグナル伝達分子として作用し、核内受容体(エストロゲン受容体ベータ)に結合し、エストロゲン-ベータ受容体複合体を形成するステロイドホルモンです。

これらのリガンド受容体複合体は二量体化し、細胞質内でホモ二量体を形成します。得られたホモ二量体は核に入り、エストロゲン応答要素であるERE(標的遺伝子のプロモーター内の特定のDNA配列)に結合し、転写を開始します。

植物エストロゲン(エストロゲン機能を模倣する植物由来の二次代謝産物)のエストロゲン活性を決定するには、適切な培地に懸濁されたレポーター細胞を含むマルチウェルプレートから始めます。

レポーター細胞は、エストロゲン受容体ベータを過剰発現するように操作され、EREプロモーターに融合したルシフェラーゼ遺伝子がトランスフェクトされます。植物エストロゲンを含むサンプル溶液を加え、インキュベートします。

インキュベーション中、植物エストロゲンはエストロゲン受容体であるベータに結合し、レポーター細胞で発現します。結合すると、植物エストロゲン受容体複合体は二量体化して核に移動します。

核内では、二量体化複合体がEREに結合します。結合によりルシフェラーゼ遺伝子の転写が開始され、ルシフェラーゼ酵素が生成されます。次に培地を取り除き、ルシフェラーゼの基質を含む試薬を加えます。インキュベートして、発現したルシフェラーゼ酵素がその基質を酸化して発光できるようにします。

サンプル中の化合物のエストロゲン活性を確認する発光を測定します。

サンプルをボルテックスします。次に、各サンプル4マイクロリットルを496マイクロリットルの化合物スクリーニング培地に加え、0.8%DMSO溶液を得ます。

予熱した細胞回収培地チューブの外面を70%エタノールで消毒し、培地10ミリリットルを凍結レポーター細胞のチューブに移して解凍します。レポーター細胞のチューブを閉じ、摂氏37度のウォーターバスに5〜10分間入れます。

ウォーターバスから細胞を取り出した後、チューブを数回静かに反転させて細胞の凝集体を分解し、均一な懸濁液を生成します。次に、チューブの表面を70%エタノールで洗浄します。

マルチチャンネルピペットを使用して、100マイクロリットルのレポーター細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに分注します。次に、100マイクロリットルのサンプルを3回に分けて適切なウェルに分注します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で22〜24時間インキュベートします。

プレートインキュベーションが終了する直前に、検出基質と検出バッファーを冷蔵庫から取り出し、室温に平衡化するまで暗い場所に置きます。次に、各チューブをゆっくりと反転させて溶液を混合します。

プレートインキュベーションが完了する直前に、検出バッファーの内容物全体を検出基質のチューブに注ぎ、ルシフェラーゼ検出試薬を作成します。泡が出ないようにチューブを軽く混ぜます。

サンプルプレートの内容物を適切な廃棄物容器に捨て、清潔な吸収性ペーパータオルで軽くたたいてウェルから最後の液滴を取り除きます。各ウェルに100マイクロリットルのルシフェラーゼ検出試薬を加え、アッセイプレートを室温で15分間休ませます。次に、96ウェルプレート読み取りルミノメーターを使用して発光を定量化します。