DNAメチル化の程度を決定するための5-メチルシトシンドットブロット

DNAメチル化は、DNAのシトシン塩基にメチル基を付加して5-メチルシトシンを形成することを含むエピジェネティックな修飾です。この修飾により、遺伝子発現が変化します。

ドットブロットによるDNAメチル化を定量するには、異なるレベルのメチル化シトシンを示す脱分化のさまざまな段階にあるヒト軟骨細胞に由来するゲノムDNAサンプルを採取します。

DNAサンプルを強アルカリの水酸化ナトリウムで処理し、加熱します。この処理により、2 本の DNA 鎖間の水素結合が切断され、DNA が変性します。酢酸アンモニウムを加えてアルカリを中和し、過度のDNA分解を防ぎます。

ナイロンメンブレンを取り、変性したDNAサンプルをドットとしてスポットします。負に帯電した DNA は、静電相互作用を介して正に帯電したナイロン膜に結合し、固体支持体にブロッティングされます。

ブロットされた膜をブロッキングバッファーで処理して、非特異的結合を防ぎます。次に、抗5-メチルシトシン抗体を膜に加え、インキュベートします。これらの抗体は、DNA上のメチル化シトシンにのみ結合します。

洗浄して結合していない抗体を除去し、一次抗体に特異的に結合する化学発光酵素結合二次抗体を加えます。

膜に化学発光基質を追加します。抗体上の酵素は基質と反応して化学発光を生成し、さまざまな強度のドットを生成します。

膜を画像化し、各サンプルのDNAメチル化の程度に対応するドットの強度を測定します。

この手順は、単離されたDNAを摂氏95度で0.1モルの水酸化ナトリウムで10分間変性させることから始めます。氷上で1モルの酢酸アンモニウムでDNAを中和し、二重蒸留水で2倍に希釈します。

ドットブロットの最も重要なステップは、サンプルをメンブレンにスポットすることであり、ゆっくりと慎重に行います。各斑点のある領域を直径3〜4ミリメートルに最小限に抑えるようにしてください。

細口ピペットチップを使用して、グリッドの中心にある正に帯電したナイロンメンブレンに、2マイクロリットルの連続希釈ゲノムDNAを注意深く見つけます。メンブレンを摂氏80度で30分間吸い取ります。次に、10センチメートルのペトリ皿で10センチメートルのペトリ皿で5%BSAのTBSTに膜を浸し、穏やかに振とうしながら1時間、非特異的抗体結合部位をブロックします。

1時間後、メンブレンをTBSTで3回、毎回5分間洗浄します。メンブレンをマウス抗5-メチルシトシンモノクローナル抗体とともにTBST中で摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、メンブレンをTBSTで3回、毎回5分間洗浄します。

次に、二次抗体である西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス免疫グロブリンGと室温で1時間TBST中でインキュベートします。先ほどのようにTBSTでメンブレンを洗浄した後、酵素基質をメンブレンに加え、5〜10分間インキュベートします。最後に、製造元の指示に従って化学発光キットを使用して二次抗体シグナルを視覚化します。