フィブリン血栓形成モニタリングのための紫外可視分光法

傷に反応して、一連の酵素反応により、血管を密閉し、過剰な失血を防ぐ不溶性タンパク質ネットワーク(フィブリン血栓)の形成が開始されます。

in vitroでフィブリン血栓形成をモニタリングするには、血栓形成バッファーを含むマルチウェルプレートから始めます。バッファーは、補因子であるカルシウムイオンと、凝固に不可欠な可溶性糖タンパク質であるフィブリノーゲンで構成されています。

トロンビン(反応を開始するタンパク質分解酵素)で井戸を処理します。

プレートを紫外可視分光光度計に挿入します。波長350ナノメートルの光でウェルを照らし、一定の間隔で溶液の吸光度を記録します。

最初に、入射光は可溶性フィブリノーゲンを含む透明な溶液を通過し、最小の光吸光度と最大の透過率を示します。検出器は透過光を収集し、溶液の濁度と相関する時間に対する吸光度を示すスペクトルを生成します。

時間が経つにつれて、カルシウムイオンの存在下で、トロンビンは可溶性フィブリノーゲンを切断してフィブリンを放出します。これらの不溶性フィブリンは相互作用してフィブリンの三次元ネットワーク(血栓)を形成し、溶液を濁らせます。フィブリン凝固を含む濁った溶液はより多くの光を吸収し、透過光の強度を低下させます。

UV-可視スペクトルを分析します。時間の経過に伴う吸光度値の増加は、溶液の濁度の増加と相関しており、急速なフィブリン血栓形成を示唆しています。

まず、

200マイクロリットルの血栓形成バッファーに1.5マイクロモルの新たに調製したフィブリノーゲンを、各Aβ陰性42含有ウェルおよびコントロールウェルに加え、室温で回転プラットフォーム上でプレートをインキュベートします。30分後、30マイクロリットルの新たに調製したトロンビン溶液を各フィブリノーゲン含有ウェルの中心に直接同時に加えて血栓形成を開始し、すぐに350ナノメートルでin-vitro血栓の吸光度を読み取り、10分間にわたって30〜60秒ごとに測定を繰り返します。