ウイルス感染を追跡するためのルシフェラーゼ蛍光レポーターインフルエンザウイルス

コンパクトなレポーター遺伝子を組み込むようにゲノムを改変した病原性組換えインフルエンザウイルスから始めます。

これらのレポーター遺伝子は、小さなルシフェラーゼ生物発光酵素と単量体蛍光タンパク質をコードしています。

麻酔をかけたマウスにウイルスを鼻腔内に接種し、その後のイメージングのために適切に剃ります。

ウイルスは宿主細胞に侵入し、その遺伝的内容を放出します。

核内で、ウイルスゲノムはmRNA分子に転写し、その後翻訳して宿主細胞でルシフェラーゼと蛍光タンパク質を産生します。

ルシフェリン基質をマウスに眼窩後に注入します。

ルシフェラーゼ酵素はルシフェリンをオキシルシフェリンに酸化し、弛緩時に生物発光シグナルを発します。

シグナルを測定してルシフェラーゼレベルを推定し、生きた動物のウイルス感染モニタリングを可能にします。

ex vivo分析の場合は、肺を切除し、適切なイメージング技術で蛍光シグナルを捕捉します。

通常の変異体とは異なり、単量体蛍光タンパク質は凝集体を形成しないため、ウイルス感染を正確に追跡するための鮮明な画像が得られます。

マウスに感染させるには、鳥インフルエンザを1X PBSで調製することから始めます。接種するまでウイルスを氷上に置いてください。マウスが麻酔されていることを確認するためにつま先ピンチ反射がないかどうかを確認し、調製した鳥インフルエンザ希釈液を鼻腔内に接種します。すべてのマウスをケージに戻す前に、すべてのマウスが適切に呼吸していることを確認してください。

イメージングソフトウェアを開き、[初期化]を押してから、イメージングに使用するパラメータを設定します。鳥インフルエンザに感染したマウスを監視するには、胸部を剃って生物発光シグナルの検出を改善します。

マウスが麻酔されたら、22ゲージの針を使用して、PBSで1〜10に希釈した100マイクロリットルのNLucルシフェラーゼ基質を眼窩後投与します。注射後すぐに、動物を胸を上に向けて隔離チャンバーに入れ、次に分離チャンバーをイメージング機器に入れ、ドアを閉めて画像を取得します。

イメージング後、マウスをケージに戻し、完全に回復するまで監視します。イメージングソフトウェアROIツールを使用して、関心領域を指定して測定をクリックすることで、取得した生物発光データを分析します。

マウス肺のex vivoイメージングを行うには、原稿の指示に従って肺を採取し、画像取得ソフトウェアを起動し、イメージングのパラメータを設定します。マシンが初期化されたら、肺を黒い背景トレイに入れ、組織が互いに分離されていることを確認します。トレイをイメージャーに導入し、ドアを閉めて画像を取得します。

イメージング後、すぐに組織を取り出し、サンプルを同日に処理する場合は摂氏4度の氷の上に保管します。後で処理する場合は、ドライアイスの上のチューブですばやく冷凍し、摂氏マイナス80度で保存してください。画像を処理するには、ROIツールを選択し、個々の肺の周囲に関心領域を描画して、[測定]をクリックします。