マウス初代小脳顆粒ニューロンの単離と培養

収穫したてのネズミの子の脳を取ります。

小脳を分離し、その膜層を取り除きます。

腹側から、血管網を取り除きます。

脳を断片に切り刻み、緩衝液を含むチューブに移します。

片を含む上清を遠心分離して廃棄します。

タンパク質分解酵素であるトリプシンを加えて、組織の細胞外マトリックスを消化し、細胞を緩めます。

トリプシン阻害剤とDNaseを含むバッファーを追加します。

阻害剤はトリプシン活性を停止し、DNaseは汚染されたDNAを分解します。

組織を機械的に解離して、小脳顆粒ニューロンおよび非ニューロン細胞またはグリア細胞を含む細胞懸濁液を形成します。

細胞懸濁液をチューブに移します。

バッファを追加します。遠心分離して上清を除去します。細胞を培地に再懸濁し、ポリ-D-リジンでコーティングされた培養プレートにプレートします。

細胞はコーティングされた表面に付着します。

代謝拮抗剤を添加して、増殖するグリア細胞を除去し、小脳顆粒ニューロンの純粋な培養物を生成します。

小脳を分離するには、硫酸マグネシウムを添加した解剖液に脳を入れ、溶液と脳を氷上に置いておく。

解剖顕微鏡下で、細い鉗子を使用して髄膜を除去します。次に、硫酸マグネシウムを添加した解剖液で脳から小脳を解剖します。これは、残りの髄膜を剥がすのに役立ち、層の間に入って小脳のひだをきれいにすることができます。

神経細胞培養における髄膜の存在は、不健康な細胞を引き起こし、最終的には細胞死を引き起こします。そのため、培養を進める前に髄膜を完全に除去することが重要です。

その後、小脳を腹側に向け、脈絡叢を確実に除去します。次に、小脳を1ミリリットルの硫酸マグネシウムを添加した解剖液を含む35ミリメートルの皿にプールします。組織を細かく刻み、30ミリリットルの硫酸マグネシウム緩衝解剖溶液を含む50ミリリットルのチューブに移します。

このステップでは、刻んだ脳組織を含む50ミリリットルのチューブを644倍gと摂氏4度で5分間遠心分離します。その後、上清を取り除き、10ミリリットルのトリプシン解剖液を加えます。その後、テーブルを37°Cで15分間高速で振る。

10ミリリットルのトリプシン阻害剤溶液-Iをチューブに加え、2分間穏やかに揺らします。続いて、チューブを644倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。5分後、上清を取り除き、2ミリリットルのトリプシン阻害剤溶液-IIを加えてから、15ミリリットルのチューブに移します。

次に、溶液が濁るまで15ミリリットルのチューブで組織を粉砕します。5分間落ち着かせます。次に、透明な上清を取り除き、1ミリリットルの塩化カルシウムを添加した解剖溶液を含む新しいチューブに移します。

さらに2ミリリットルのトリプシン阻害剤溶液-IIをペレットを含むチューブの底に加えます。もう一度すりつぶし、5分間静かにします。上清を取り除き、前のステップで上清を含むチューブに加えます。組織の大部分が機械的に解離するまで、このプロセスを繰り返します。

清1ミリリットルごとに、0.3ミリリットルの塩化カルシウムを添加した解剖溶液を上清コレクションに加えます。チューブの内容物を混合し、室温で644回gで5分間遠心分離します。その後、上清を取り除きます。10ミリリットルの新鮮な培地をペレットに加え、混合します。

次に、生細胞を数え、1ミリリットルあたり1.5 x 10⁶細胞の濃度に希釈します。事前に調製したポリ-D-リジンプレートに細胞をプレーティングします。4ウェルプレートの場合、0.5ミリリットルのサンプルを配置し、ウェルあたり7.5 x 10⁵細胞を与えます。35ミリメートルの皿の場合、4ミリリットルのサンプルをプレートし、プレートあたり6 x 10⁶セルを与えます。カバーガラスの場合は、0.5mlをプレートし、ウェルあたり7.5 x 10⁵細胞を与えます。

24時間後、AraCをプレートに2つ加えて、グリアの汚染を減らします。細胞を7〜8日間維持する場合は、3日目にこの処理を繰り返し、摂氏37度の5%CO₂インキュベーターで培養物を維持します。