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の下部領域内の領域である腹側海馬領域を含む出生後のマウスの脳冠状切片から始めます。
腹側海馬組織を切断し、適切な培地に移します。
組織を細かくスライスし、マルチウェルプレートのマトリックスコーティングされたカバーガラスに貼り付けます。
組織からのニューロンは、投影を拡張し始めます。
次に、マウス胚由来の側坐核、前脳の奥深くにある小さな組織を取ります。
側坐核組織を細かく切ります。それらをチューブに移します。
消化酵素を添加して細胞外マトリックスタンパク質を解離します。酵素レベルを下げるために洗浄します。
組織片を上下にピペットで移動させて、単一細胞を生成します。
細胞を遠心分離します。上清を取り除き、細胞を再懸濁します。
この懸濁液を腹側海馬組織とともにカバーガラスに加え、インキュベートします。
腹側海馬組織片からの神経終末は側坐核の神経細胞と接続し、シナプスと呼ばれる通信結合
を形成します。組織採取の前に、12 mmのポリ-D-リジン合わせコーティングされたガラスカバーガラスを、24ウェル組織培養プレート内で500マイクロリットルの培地とともに摂氏37度で少なくとも30分間プレインキュベートします。次に、マイクロスライスをめっきする前に培地を取り除きます。培養用の組織を採取するには、頭蓋骨の上部を取り除き、犠牲になった各子犬の脳全体を露出させます。
解剖顕微鏡下で、大脳皮質が尾側に互いに離れる接合部から始めて、腹側海馬を含む後皮質を含む冠状切片を取得します。次に、CA1-subiculum領域を含む腹側海馬組織を解剖します。その後、組織を冷たい培地を含む35ミリメートルの培養皿に移します。
その後、組織をさらに小さく薄いスライスに切ります。外植片の取り付けを容易にするために、カバーガラスの中央に50マイクロリットルの培地で火で研磨されたパスツールピペットでスライスをプレートします。次に、カバーガラスに腹側海馬のマイクロスライ
スをプレートします。外植片がカバーガラスに落ち着いたら、壁のそばに100マイクロリットルの追加培地をそっと追加して、培地のレベルがカバーガラスの中央にある外植片を完全に覆うのに十分な高さになるようにします。次に、側坐核ニューロンが分散する前に、外植片を摂氏37度の5%CO2で一晩インキュベートします。次に、胚18日目から生後1日目の野生型マウスまでの側坐核組織を取得します。
それらを細かく切ります。次に、それらを15ミリリットルのチューブに移します。2ミリリットルの0.25%トリプシンで組織を摂氏37度で15分間処理します。続いて、5ミリリットルの摂氏4度の洗浄培地で組織を3回洗浄し、各洗浄ステップで懸濁液を5分間休ませます。
次に、5ミリリットルの摂氏4度の培地で組織を1回洗浄します。次に、軽く火で研磨したパスツールピペットを使用して、2ミリリットルの培地中で穏やかに粉砕して細胞を解離させます。その後、細胞懸濁液を別の15ミリリットルチューブに移し、2,000 RPMで5分間遠心分離します。
5分後、上清を取り除き、6匹あたり1ミリリットルで細胞を培地に再懸濁します。次に、火で研磨されたパスツールピペットで培地を数回穏やかにピペッティングして細胞を分散させます。最後に、0.25ミリリットルの分散した側坐核細胞を、腹側海馬外植片のある各カバーガラスに加えます。シナプス形成を促進するために、湿った滅菌ガーゼパッドに培養プレートを置き、機械的に安定させ、湿度を維持します。次に、プレートを摂氏37度の5%CO2でインキュベートします。