後根神経節外植片の生成と解離細胞培養

血清培地中の後根神経節またはDRG組織から始めます。DRG組織には、細胞外マトリックスであるECMに埋め込まれた感覚ニューロンとサテライトグリア細胞が含まれています。

組織の接着を強化するために、ゼラチン状のタンパク質混合物でコーティングされた培養皿に播種します。

時間が経つにつれて、グリア細胞は神経細胞の伸長を可能にする神経栄養成長因子を放出し、DRG外植片培養を確立します。

解離細胞培養を開発するには、これらのDRG外植片をチューブに入れます。コラゲナーゼで処理してECMを分解し、次にトリプシンで処理し、細胞接続を破壊してニューロンとグリア細胞を放出します。

酵素反応を止めるために、血清が豊富な培地を加えます。

内容物を繰り返しピペットで移動させて単一細胞懸濁液を作成し、ろ過して破片を除去します。

この細胞懸濁液を遠心分離し、酵素含有上清を除去します。

細胞を神経基底培地に再懸濁し、ラミニンでコーティングされたプレートに移します。

サテライトグリア細胞と感覚ニューロンは、ラミニンでコーティングされたプレートに付着し、解離した細胞培養を確立します。

各DRGを乾燥したガラス製ペトリ皿に移します。手術用顕微鏡下で、ブレードを使用して、DRGに付着したままの余分な繊維と結合組織を洗浄し、切り取ります。DRG は、白色脊髄神経に沿った膨らんだ透明な構造として簡単に識別でき、DRG の周囲に血管がよく見られます。

その後、DRGに洗浄したものを、氷冷で無血清の培地を含む新しいペトリ皿に入れます。ゼラチン状タンパク質混合物を氷冷の無血清培地で1対1の比率で希釈します。次に、10または20マイクロリットルのゼラチン状タンパク質混合物でプレコートした12ウェルプレートにDRGをex vivoでプレートし、摂氏37度で30〜60分間保持します。

次に、1.5〜2ミリリットルの無血清培地を培養システムにそっと加えて、外植片全体を覆い、外植片を培養条件に維持します。DRG増殖培地は72時間ごとに交換します。DRG を必要なだけ成長させます。

DRGはゼラチン状のタンパク質ミックスを使用してガラスプレートに固定されるため、これは重要なステップです。したがって、浮遊を避けるためには、重合の時間とピペッティングのスキルが重要です。

この手順では、収集したすべてのDRGを、コラゲナーゼIVを含むF12培地を含む1.5ミリリットルの滅菌チューブに入れ、摂氏37度で45分間インキュベートします。その後、コラゲナーゼIVを含む新鮮な培地を交換し、サンプルをさらに45分間インキュベートします。次に、0.025%トリプシンを含む2ミリリットルのF12培地で37分間、外植片を30分間処理します。

コラゲナーゼIV処理の直後に、ウシ胎児血清を含む2ミリリットルのF12培地と摂氏37度で15分間インキュベートします。その後、外植片を2ミリリットルのF12培地で3回洗浄し、培地が濁るまでガラスピペットで機械的に解離させます。

その後、解離した細胞培養物を0.22マイクロメートルのフィルターでろ過し、不純物や余分な結合組織を除去します。次に、ろ過した細胞ライセートを2分間遠心分離します。上清を除去し、細胞ペレットを500マイクロリットルの神経基底培地に再懸濁します。解離した細胞を、ラミニンでコーティングされたカバースライドに好ましい細胞密度で配置します。