海馬組織からのニューロスフェアの形成と拡大

自己複製能力を持つ神経幹細胞と前駆細胞が豊富な脳組織である出生後のマウス海馬歯状回から始めます。

組織の細胞外マトリックスを解離させ、細胞を緩めるトリプシン酵素を追加します。

次に、酵素を取り除き、バッファーで組織を繰り返し洗浄します。

バッファーを成長因子が豊富なニューロン培地に交換します。

ピペットで組織を解離し、細胞を培地に放出します。

希釈した細胞懸濁液をコーティングされていないシャーレに播種し、インキュベートします。

幹細胞と前駆細胞は、栄養素と成長因子を利用して増殖します。

時間が経つにつれて、それらは自発的に凝集し、不均一な細胞集団を持つ一次神経圏と呼ばれる自由に浮遊する3次元構造を形成します。

これらの神経球を集め、上清を捨てます。神経球をニューロン培養培地に再懸濁し、単一細胞懸濁液に解離します。

これらの細胞をコーティングされていないシャーレで再培養して、比較的均質な細胞集団を持つ二次神経球を形成します。

SVZおよびDGサンプルを解離するには、HBSS中のトリプシン-EDTAの最終濃度5%から10%のトリプシン-EDTA 0.05%を各チューブに加え、摂氏37度で約15分間インキュベートします。

トリプシンの過剰使用やインキュベーション時間が長すぎると、細胞死が増加し、細胞増殖に悪影響を与える可能性があります。

そして、組織が凝集し、4回連続して洗浄する酵素溶液を、洗浄ごとに1ミリリットルの新鮮な補充されたHBSSに置き換えます。最後の洗浄後、消化した組織を1ミリリットルの無血清培地に再懸濁し、1ミリリットルあたり10ナノグラムの上皮成長因子、およびチューブあたり1ミリリットルあたり5ナノグラムの塩基性線維芽細胞成長因子を補充します。

次に、均質な細胞溶液が得られるまで、P1000ピペットで7〜10回穏やかなピペッティングで組織を機械的に解離します。SVZ細胞内の解離したDGの密度を決定するには、血球計算盤で各懸濁液中の細胞をカウントします。

細胞を神経球に増殖させるには、成長因子を添加した無血清培地で、個々の細胞集団を1ミリリットルあたり2 x 10⁴細胞密度で希釈し、5ミリリットルの細胞懸濁液をコーティングされていない直径60ミリメートルのペトリ皿に播種します。次に、SVZ細胞を摂氏37度で6〜8日間インキュベートし、DG細胞を摂氏37度で10〜12日間インキュベートして、一次神経球を形成します。

神経球の大部分の直径が150〜200マイクロメートルの場合、培養物から細胞懸濁液を採取し、遠心分離によって神経球を収集します。製造元の指示に従って、マウス化学解離キットで神経球ペレットを再懸濁します。

別の遠心分離で細胞を採取する前に、上清を成長因子を添加した1ミリリットルの無血清培地に置き換え、ペレットを約10回穏やかに粉砕します。

実証されているように解離した神経細胞を数え、成長因子を添加した無血清培地で、1ミリリットルあたり2 x 10⁴細胞密度で細胞を再播種し、新しい60ミリメートルのペトリ皿に入れます。次に、細胞を細胞培養インキュベーターに戻して、必要に応じてさらに6〜8日間、または必要に応じて10〜12日間戻して、二次神経球を取得します。