初代胚性マウス中脳ドーパミンニューロンの単離と培養

マウス胚の中脳の腹側領域から単離された中脳底組織を取ります。

組織には、神経伝達物質ドーパミンを放出するドーパミンニューロンが豊富

酵素溶液を加えて組織マトリックスを分解し、それによって細胞を緩めます。

DNase Iを含む血清溶液を加え、消化された組織を機械的に解離して細胞懸濁液を生成します。血清タンパク質は酵素を阻害し、DNase I は細胞溶解中に放出される細胞外 DNA を分解し、細胞の凝集を防ぎます。

組織の破片を沈殿させ、浮遊細胞を新しいチューブに移します。

上清を遠心分離して除去し、細胞をドーパミンニューロン培地(DPM)に再懸濁します。

ウェルの中心に細胞培養基質でコーティングされたマイクロプレートを取り、マイクロアイランドを作成します。

細胞をマイクロアイランドの中央に移して高密度で培養します。

キュベートして、細胞がマイクロアイランドに付着できるようにします。

ウェルにDPMを充填してインキュベートし、ドーパミンニューロンの成長を促進します。

マウス胚13.5日目のマウス胚から初代胚性中脳培養物を設定するには、採取したすべての中脳床を同じ1.5ミリリットルのチューブにプールし、洗浄ごとに500マイクロリットルのカルシウムおよびマグネシウムを含まないHBSSでサンプルを3回洗浄します。最後の洗浄後、HBSSを0.5%トリプシンに交換し、摂氏37度で30分間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、FBS溶液中の新たに調製したDNase Iを500マイクロリットルを部分的に消化した組織に加え、火で研磨されたチップを備えたシリコン化ガラスピペットを使用して組織を粉砕します。小さな、ほとんど見えない粒子しか観察できない場合は、これらの組織片を微量遠心チューブの底に沈殿させ、上清を空の15ミリリットルの円錐形ポリプロピレンチューブに移します。

FBS中のDNase Iを含むチューブに1ミリリットルのHBSSを加え、ピペッティングで数回混合します。この溶液1ミリリットルを残りの組織粒子に移し、サンプルを再度粉砕します。次に、残りの組織断片を移すことなく、消化された細胞懸濁液を上清のチューブとプールします。HBSのFBSに残ったDNase Iで組織サンプルをもう一度粉砕した後、遠心分離により採取した細胞を沈殿させ、ペレットを乱すことなく上清を吸引します。

洗浄ごとに2ミリリットルの温めたドーパミンニューロン培地で細胞を2回洗浄し、微量遠心チューブ内で6マイクロリットルの新鮮で温められた培地濃度あたり3 x 10⁴細胞で細胞を再懸濁します。次に、事前に調製した各マイクロアイランドから培地を取り出し、10マイクロリットルのピペットを使用して各マイクロアイランドに6マイクロリットルの細胞を追加する前に、穏やかなピペッティングで細胞を混合します。

すべての細胞が添加されたら、プレートの端にある空のウェルに150マイクロリットルの水またはPBSを入れ、プレートを細胞培養インキュベーターに1時間入れます。インキュベーションの最後に、100マイクロリットルの新鮮なドーパミンニューロン培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。