Caenorhabditis elegansニューロンに対する農薬の影響の研究

ニューロンに緑色の蛍光タンパク質またはGFPを発現するトランスジェニックCaenorhabditis elegansを含む寒天プレートから始めます。

プレートに滅菌水を加え、旋回させてワームを持ち上げ、チューブに移します。

ワームを落ち着かせてから、余分な水を取り除き、再懸濁します。

再懸濁したワームを農薬でコーティングされたプレートと農薬を含まないコントロールプレートに移し、インキュベートします。

それらの作用に基づいて、殺虫剤は特定のニューロンに特異的に損傷を与え、ニューロンの腫れを引き起こし、GFP 発現を低下させます。

酔薬を含むアガロースパッドにワームを移し、カバーガラスを置きます。

スライドを蛍光顕微鏡に取り付けます。まず、位相差モードを使用してワームを視覚化し、次に蛍光モードに切り替えます。

殺虫剤で処理されたワームでは、ニューロンは蛍光の低下、体細胞の腫れ、およびニューロンプロセスのギャップを示し、神経変性効果を示しています。

制御中、健康なニューロンは明るい蛍光で無傷の体細胞を示します。

マイクロピペットの場所を使用して、1ミリリットルの滅菌水を線虫のプレートに塗ります。次に、水をふさわしくして線虫を持ち上げます。次に、線虫を含む液体を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに取り除きます。10分後、線虫が重力で落ち着くので、少なくとも500マイクロリットルの水を慎重に取り除き、廃棄します。

次に、線虫を再懸濁し、カットオフされた黄色のピペットチップを使用して、50〜100マイクロリットルの浮遊ワームを各処理プレートに除去し、各プレートに少なくとも10匹の成虫がいることを確認します。スライドの片面だけにラベルテープを貼り、均一な厚さのパッドを形成して、2枚のスライドを準備します。

次に、清潔で未使用のスライドをベンチトップのそれらの間に置きます。マイクロピペッターを使用して、溶かしたアガロースを10マイクロリットルの滴をスライドの中央に置きます。次に、ドロップのあるスライドに対して垂直に別のきれいなスライドを上に置いてドロップを平らにし、圧力を加えてアガロースドロップがラベリングテープの厚さを形成します。

その後、一定の圧力を加えて 2 つのスライドを分離します。次に、寒天面を上にしてスライドをベンチトップに置き、1〜2分間乾燥させてから使用します。アガロースパッドで準備したスライドに線虫を追加するには、1モルのアジ化ナトリウムを含む5マイクロリットルの水を寒天パッドに加え、ワームを麻薬

次に、ワームピックを使用して、処理スライドごとに少なくとも10個の線虫を液滴に移し、線虫を移す前後に滅菌する必要があります。次に、鉗子を使用してカバーガラスを斜めに置き、ゆっくりと下げて追加します。

その後、準備したウェットマウントを蛍光顕微鏡に置き、最初に10倍の倍率と位相差で、次に位相差と蛍光照明で40倍の倍率でワームを観察します。

準備したウェットマウントを一度に1つずつ顕微鏡ステージに置き、顕微鏡ステージクリップを使用して所定の位置に固定します。次に、最低倍率の対物レンズ(通常は10倍)でウェットマウントの表示を開始し、明視野または位相コントラストを使用して線虫を視覚化し、焦点を合わせます。

線虫が視野内に入ったら、顕微鏡のファインフォーカスノブを使用して線虫に焦点を合わせます。次に、ダイヤルを回して照明を蛍光に切り替え、光をカメラに向けてデジタル画像をキャプチャします。

次に、イメージングソフトウェアを使用して照明を調整し、ニューロンが明るく照らされるが、過飽和にならないようにします。ある時点で、セル画像と同じ倍率で定規の別の画像を取得して、その図の倍率スケールを提供します。