グリア細胞のシングルセルイメージングのためのショウジョウバエ脳の免疫蛍光染色

細胞特異的リコンビナーゼ系を持つさまざまな種類のグリア細胞を含むトランスジェニックショウジョウバエの脳から始めます。

これは、同じタイプの細胞上の異なる抗原エピトープに融合した細胞表面タンパク質の発現を促進します。

組織を固定剤で処理してタンパク質を架橋し、組織構造を維持します。

余分な固定剤を取り除くために洗浄します。

ブロッキングタンパク質を添加して非特異的結合部位をマスクし、バックグラウンド染色を減らします。

グリア細胞に発現するさまざまなエピトープに結合する一次抗体カクテルで組織をインキュベートします。

して結合していない一次抗体を除去します。

一次抗体に結合する蛍光色素結合二次抗体とインキュベートします。

して結合していない二次抗体を除去します。

脳をイメージングスペーサーの中に取り付け、カバーガラスを置きます。スペーサーは組織用のチャンバーを作成し、その三次元構造を維持します。

異なる蛍光色素結合抗体で標識された同じタイプの異なるグリア細胞により、細胞間相互作用の理解が可能になります。

P10ピペットチップを使用して、単離された脳を固定液を含む200マイクロリットルの微量遠心チューブに移します。鉗子を使用して脳を扱わないでください。光から保護された組織をインキュベートします。溶液の移送中に脳を吸引することは避けてください。

固定剤を取り除くには、洗浄液で15分間の洗浄を3回以上使用します。次に、ブロッキング溶液で組織を30分以上ブロックします。次に、ブロッキング溶液を洗浄液で希釈した一次抗体に置き換え、脳を摂氏4度で一晩インキュベートします。

一次抗体を除去するには、洗浄液で1時間洗浄を3回使用します。次に、二次蛍光色素結合抗体を洗浄液に加え、脳を摂氏4度で一晩、または室温で4時間インキュベートします。結合していない抗体を完全に洗い流すには、洗浄液で1時間洗浄を3回使用し、その後PBSで長時間洗浄します。

次に、脳をマウントします。イメージングスペーサー付きのカバーガラスを2枚用意します。スペーサーと追加のカバーガラスに、色あせ防止剤を含む10マイクロリットルの封入剤を塗布します。次に、P10ピペットを使用して、脳をカバーガラスに移し、PBSとともに培地の隣に沈着させます。組織を乾燥させないでください。

次に、ピペットを使用して、脳を封入剤に慎重に移動させます。そして最後に、スペーサーの媒体に移動し、鉗子で配置します。次に、スペーサーの粘着ライナーを取り外し、カバーガラスを取り付けます。鉗子を使用してカバーガラスを少し圧力で固定し、すぐにイメージングを進めます。