成人ショウジョウバエ脚における蛍光標識運動ニューロンのイメージング

2つのカバーガラスの間のスペース内に取り付けられた固定された遺伝子組み換えショウジョウバエの脚を含む共焦点顕微鏡セットアップから始めます。脚の運動ニューロン軸索は、膜タグ付き蛍光タンパク質を発現します。

1 つのレーザーと 2 つの検出器を使用して、運動ニューロン軸索からの蛍光信号と、脚の最外層であるキューティクルのバックグラウンド自家蛍光をキャプチャします。

最適な解像度と画質を得るためにイメージング設定を調整します。

明るさを微調整して、明るい軸索信号と飽和キューティクルの自家蛍光を確保します。

軸索シグナルとキューティクル自家蛍光の両方で画像をキャプチャします。

適切な画像処理ソフトウェアを使用して、キャプチャした画像を開きます。

チャネルを分割し、軸索信号からバックグラウンドキューティクル自家蛍光を差し引きます。

両方の信号の明るさとコントラストを調整して、画像の鮮明さを向上させます。

チャネルをマージしてマージされた画像を生成し、脚セグメント内の運動ニューロン軸索を視覚化します。

脚を画像化するには、488ナノメートルのレーザーと2つの検出器を同時に使用して、GFPとキューティクルの自家蛍光の両方を取得するための最初のトラックを設定します。20〜25倍の油浸対物レンズを選択し、解像度を1024 x 1024ピクセル、深度12ビットに設定します。そして、z間隔を1マイクロメートルに設定します。スライドを顕微鏡ステージにセットします。

そして、両方の検出器に同じレーザー出力を使用して、最初の検出器のゲインを調整して、明るいGFP信号を取得します。そして、2番目の検出器を調整して、キューティクル信号が高い一部の領域がこの検出器で飽和信号を生成するようにします。次に、脚が伸びている場合、または大きすぎて 1 つのフレームで画像化できない場合は、タイルまたは位置オプションを使用して脚全体をキャプチャします。

画像処理の場合は、ImageJ Fiji で共焦点スタックを開きます。また、formats プラグインを使用して、TIFF 形式ではない画像を開きます。チャンネルを分割するには、画像、カラー、およびチャンネルの分割を選択します。GFP信号からキューティクル信号を差し引くには、プロセスと画像計算機を開き、検出器1のスタックをImage1として選択します。

操作ウィンドウで、減算を選択し、検出器2からトラックをImage2として選択すると、内因性GFP信号のみが得られます。Image、Stacks、Z Protectを使用して、内因性GFP信号の最大強度投影を生成します。明るさコントロールウィンドウのコントロールを使用して、明るさとコントラストを調整します。