フローサイトメトリーを用いたマウス神経組織における免疫細胞の解析

マウス坐骨神経および後根神経節またはDRGから単離した細胞を採取します。

CD45およびCD11bに対する蛍光色素タグ付き抗体、およびMHCクラスIIに対するビオチンタグ付き抗体とインキュベートして、免疫細胞を標識します。

ビオチンに結合する蛍光色素タグ付きストレプトアビジンとインキュベートします。

細胞構造を安定させるために固定剤で治療します。

蛍光DNA染色を含む透過処理バッファーを導入して、膜を透過処理し、核を標識します。

フローサイトメーターを使用して、細胞をレーザービームに通し、光学特性と蛍光特性を評価します。

DNA蛍光で凝集体を除去して単一細胞を単離し、マーカーから蛍光を検出します。

免疫細胞の特徴的なマーカーであるCD45を発現する細胞を同定し、その存在を確認します。

DRG のほとんどの CD45 陽性細胞は CD11b および MHC クラス II を発現しており、坐骨神経には存在しないミクログリア様細胞を示しています。

この技術は、神経組織内の免疫細胞の不均一性を分析するためのイメージングを補完します。

コンピューターで、目的の蛍光色素の検出に適切なチャネル、サンプルの適切な流量、およびサンプルごとに収集されるイベントの総数を選択します。イベントの最小数は 100 万である必要があります。

次に、側面散布Aと前方散乱Aのグローバルワークシート下、および対象の蛍光色素と前方散乱Aの散布図を作成します。また、選択した蛍光色素のイベント数と平均蛍光強度を表示する統計ビューを作成します。

DAPIのみの染色コントロールからの散布図に基づいて親ゲートP1を決定します。サンプルをフローサイトメトリーに添付し、[取得]をクリックします。DAPI対FSCプロットを観察し、DAPIプラス集団が見えるようになるまでDNAパシフィックブルーチャネルの電圧を下げます。四角形ゲート ツールを使用して、DAPI プラスの母集団の周囲にボックスを描画します。これは P1 ゲートを表します。各蛍光色素の散布図を選択し、DAPIプラスイベントのみを表示します。これは、各蛍光色素のバックグラウンド蛍光を表します。

長方形ゲーティングツールを使用して、各蛍光色素の散布図に、y軸の103から始まるボックスを描画します。このゲートは、記載された各マーカーの陽性イベントが見つかる領域を表します。DAPIのみの染色コントロールを使用して、各蛍光色素の電圧を調整します。サンプルをフローサイトメトリーに添付し、[取得]をクリックします。

各蛍光色素のDAPIプラス母集団の位置を観察し、母集団が長方形ゲートの外側に収まるようにそれぞれの電圧を調整します。フローサイトメーターをセットアップしたら、サンプルを実行し、さらに分析するために前方散乱ファイルをエクスポートします。