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Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

幼虫の心臓の解剖、少年と大人ゼブラフィッシュ、ゼブラフィッシュ

Full Text

21,946 Views

06:43 min

September 30, 2011

DOI: 10.3791/3165-v

Corinna Singleman¹, Nathalia G. Holtzman¹

¹Department of Biology,Queens College, City University of New York

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

複数の発達段階におけるゼブラフィッシュの心臓の解剖と分離のための明確な、標準化された方法が説明されています。注釈と定量化の手法についても説明します。

Transcript

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュから心臓を取り除くことです。これは、最初にゼブラフィッシュを収集して固定することによって達成されます。次に、体腔を開いて心臓を視覚化します。

次に、心臓を切除し、心臓以外の組織を取り除きます。最後に、ハートを撮影します。最終的には、時間の経過に伴う心臓の形態は、顕微鏡検査、切片作成、および写真撮影を通じて見ることができます。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、解剖の鍵として重要です。ゼブラフィッシュは小さく、組織の色がはっきりしておらず、識別が難しいため、Staを学ぶのが困難です。これらの実験では、成魚と個々のナシまたはグループ交配を行います。

胚を洗浄し、摂氏28度のインキュベーターに保管します。受精後5日目に、魚を10〜15の魚密度のタンクに分け、魚の施設に入れます。適切な年齢で魚を水槽から取り出し、0.2%トリカに入れて麻酔をかけます。

麻酔をかけた魚を氷水に15分間入れて安楽死させます。その間、皿に1つのXPBSに4%パラホルムアルデヒドまたはPFAを追加します。採取した魚を4%PFA中で室温で1〜2時間インキュベートし、その後、パーフィルで包んだシャーレで摂氏4度で一晩インキュベー

トします。

これにより、魚は平らに保たれ、固定後の解剖がはるかに簡単になります。0.1%TweenまたはPBTでPBSで2回すすいで、魚は摂氏4度のPBTで最大10日間保存できます。新鮮なPBSを半分入れたシャーレに1匹の魚を入れ、右側に置きます。

デジタルミリキャリパーを使用して、尾びれを含まない鼻から尾の付け根までの魚の長さを測定します。これが標準の長さまたはslです。各魚に数字の組み合わせを割り当てて、個々の魚とその結果として解剖された心臓を後で分析するために追跡できるようにします。

すべての測定値を含むすべてのデータをスプレッドシートに入力し、これらのラベルに基づいて整理してから解剖します。PCRチューブストリップにトラッキング番号を割り当てて標識し、さらなる分析に適したPVTまたはその他の溶液をチューブに充填します。鉗子で体を安定させながら、魚の腹側部位をペトリ皿に向け、標準の長さが12ミリメートル未満の魚の目と鰓の間に頭を保持します。

鋭利な鉗子またはピンホルダーのマイクロニードルを使用します。胸筋とヒレを体から取り除き、心臓を露出させます。解剖中の鉗子の絶え間ない動きは、魚を動かすPPT内の電流を引き起こす可能性があります。

これは、小さな魚にとって特に問題になります。したがって、マイクロニードルを使用して胸筋とフィンを取り除き、体腔を開く必要があります。鉗子を使用して、心房の下から空洞から心臓をそっとすくい取ります。

魚に蛍光心臓マーカーが含まれている場合は、解剖に蛍光スコープを使用し、蛍光による心臓の除去を確認します。心臓が空洞から取り出されたら、鉗子を使用して心臓を保持し、マイクロニードルを使用して余分な非心臓組織と心外膜を心臓の外側から取り除きます。標準の長さが12ミリメートルを超える魚用。

スプリング柄のマイクロハサミを使用して、3つの切開を行います。まず、えらに横方向の切り込みを入れます。次に、前腹で別の横方向の切り込みを入れます。

そして第三に、両方の横方向の切り込みを接続する腹側に矢状切り込みを入れます。鋭い鉗子を使用して、胸筋とひれを体から取り除き、体腔を開き、心膜の銀色の組織を明らかにします。この心膜組織を取り除くと、心臓が見えてきます。

マイクロハサミを使用して、心臓の上に位置する球状動脈症に接続されている動脈を切断します。この動脈が切断されたら、鉗子の先端を心房の下に置き、鉗子を使用して心臓を空洞からすくい取ります。心臓に付属している余分な組織があれば、後で取り除くことができるので問題ありません。

あるいは、一部の魚では、球根をそっと引き抜くことで心臓を取り除くことが可能であり、心臓の残りの部分がそれに続きます。アトリウムは簡単に損傷する可能性があるため、別の手法を使用する場合は、アトリウムの位置に注意してください。心臓に付属している余分な組織がある場合、これは問題なく、後でクリアすることができます。

心臓が空洞から取り除かれたら、2つの鉗子を使用して心臓を保持し、余分な組織を取り除くか、心臓を保持するための1対の鉗子とマイクロニードルを使用して余分な非心臓組織を取り除きます。ゼブラフィッシュの心臓を撮影するには、1リットルあたり23グラムの栄養寒天シャーレを準備し、固化した寒天をPBSで覆います。鉗子を使用して、寒天に井戸を作り、心臓が適切な向きに収まるようにします。

球根の先端を持ってPCRチューブから心臓を取り出します。鉗子をしっかりつまんで。寒天皿に心臓を入れます。

寒天の心臓を写真に向けます。サンプルは、各写真の後にすべての可能な向きに回転させることができます。オーバーヘッド、光、短い露光時間を使用して、心臓を撮影します。

必要に応じて露出を使用して光の質を調整し、最高の写真を撮ります。よく解剖されたきれいな心の例がここに示されている。各心臓には全体的な形態にいくつかの違いがありますが、心臓は無傷の心室心房とその発生後の球根状動脈症を含む完全でなければなりません。

この技術は、ゼブラフィッシュの心臓発生分野の研究者が、ゼブラフィッシュの心臓発生のさまざまな段階における心臓の成熟を探求する道を開きました。

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