成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

このプレゼンテーションの目標は、まず生存可能な成体マウス心筋細胞の単離を説明し、次に2つのシングルセル遺伝子発現解析法を示すことです。マウスから心臓を解剖した後、心臓にコラゲナーゼ消化溶液を灌流して単一細胞を得ます。単一細胞の定量的PCRでは、精製された細胞を直接QPCRアッセイにかけます。

単離された心筋細胞は、マイクロアレイ解析にも使用できます。単一細胞のマイクロアレイ解析には、mRNAの抽出、プレックスライブラリーによる全トランスクリプトーム増幅、限定的な増幅、最後に標識とマイクロアレイチップへのハイブリダイゼーションが含まれます。両方の手順の最後のステップは、高品質のデータを確保することです。

これらの手順は、個別に単離された成体心筋細胞から堅牢な遺伝子発現解析が可能であることを示しています。この方法が、全組織ホモジネートの遺伝子発現プロファイリングなどの既存の方法よりも優れている点は、シングルセル遺伝子発現により、シングルセル内での発現に関する情報や、細胞間の発現のばらつきに関する情報を取得できることです。必要な溶液と終末鎮静剤、0.25ミリリットルのIP注射を施したマウス、ペントバルビタールナトリウム溶液を含む準備された単離システムから始め、マウスが意識を失い、痛みの刺激に反応しないことを確認します。

マウスが停止する前に、二酸化炭素や子宮頸部脱臼を使用してマウスを安楽死させないでください。呼吸は慎重にカット。横隔膜を通して胸部縁に沿って胸腔を開きます。

次に、上向きにカットし、前胸郭を反射します。あらかじめカットされたプラスチック製ピペットに心臓をそっと吸い込み、胸部から心臓を切除します。心臓を氷のように冷たい消化に落とします。

バッファーAを洗浄し、15〜45秒後に血液を洗い流し、2回目の短時間のすすぎを行い、バッファーAをバッファーAで心臓をシャーレに移し、解剖顕微鏡下に置きます。大動脈とその枝を慎重に分離します。大動脈を最後の枝より少し下になるようにトリミングします。

カニューレの先端を冠状動脈の上の大動脈にフィットさせ、4 OHまたは6 OH縫合糸で所定の位置に結紮します。消化バッファーAを使用して灌流を開始します.血液が心臓から洗い流されると、流出は赤から透明に変わります。動物を解雇してから心臓をプロフュージョンリグに接続するまでにかかる時間は重要です。

理想的には、これを5分から10分未満に保つ必要があります。また、プロフュージョンリグを流れる流体の温度は、摂氏37度に保つ必要があります。暑すぎたり寒すぎたりすると、組織が破壊されます。

血液が心臓から洗い流されたら、消化器の使用に切り替えます。バッファーbは、心臓が形を失い始め、丸みを帯びたように見え始めるまで、心臓を2〜3分間灌流します。灌流が進むと、心室が切り取られ、それらを細かく刻むと、心筋が軽く見えるはずです。

心室組織を、15ミリリットルの温かい収集緩衝液を含む50ミリリットルの円錐管に入れます。緩衝液中の組織をプラスチックピペットで穏やかに混合し、単一細胞心筋細胞混合物を作ります。1分後、混合物を新しいチューブに移し、ペレットが形成された後に沈殿させます。

スーパーネームドを捨てて復活します。ペレット化した細胞を5ミリリットルの中和洗浄緩衝液に懸濁します。これで、シングルセル解析のためにセルを選択する準備が整いました。

細胞を小さなペトリ皿で希釈して、個別に選択できるようにします。顕微鏡下で、エアロックに取り付けられたプルピペットを使用して健康な個々の細胞を選択します。細胞をピッキングする際は、コンタミネーションを避け、捕捉量を2マイクロリットル未満に抑えてください。

個々の細胞を個々のPCRチューブの底に置き、ドライアイスですぐに凍結します。次に、細胞をマイナス80°Cで保存し、目的の遺伝子のすべてのプライマーペアを100マイクロモルと1つのXDNA懸濁バッファーで再懸濁し始め、プライマーペアを組み合わせて20マイクロモルに希釈します。最後に、すべてのプライマーペアを最終濃度200ナノモルの1つの溶液に希釈します。

プライマー溶液を調製したら、マスターミックスを組み立て、凍結細胞を直ちに冷凍庫から取り出し、最大力で30秒間遠心分離します。次に、各チューブに9マイクロリットルのマスターミックスを加え、PCRを進めます。PCRマシンからチューブを取り外し、各反応に4マイクロリットルのエキソスを加えます。

次に、各反応を摂氏37度で15分間実行し、続いて摂氏80度で15分間実行します。摂氏4度で保持して仕上げます。次に、サンプルをDNA懸濁液バッファーで1〜5個希釈します。

これで、サンプルは定量PCR分析の準備が整いました。現在、この材料と流体のIMS BIOMARKシステムは、48ポイント48または96ポイント96遺伝子発現アレイを使用して使用しています。96ウェルや3 84などのより伝統的なQPCRフォーマットを使用することが可能です。

しかし、ウェルフォーマットでは、単一細胞から実行できるアッセイの数が制限されます。このプロセスでは、SigmaのWTA twoキットを使用しており、ペレットとシングルセルの両方から二本鎖CDNAを増幅できます。このキットは、最初に単一細胞の膜を破壊し、次にメッセージを2ラウンドで増幅します。

ライブラリ調製ステップを実行した後、ライブラリサンプルの5分の1をWTA 2増幅マスターミックスの70マイクロリットルに加え、キットのパラメータを使用してサンプルを25サイクル増幅します。次に、カヤッククイックPCR精製キットを使用してサンプルを精製し、Cainのカヤックキューブで処理します。終了したら、精製したサンプルをスピードバキュームを使用して5マイクロリットルに濃縮し、WTA 2キットを使用して、前の増幅と同じパラメータを使用してサンプルをさらに17サイクルの増幅にかけます。

前と同じようにサンプルを精製し、NanoDrop分光光度計とAgilentのバイオアナライザーDNA 7、500キットを使用して品質を確認します。次に、Nimble Genの1色ラベリングキットを使用して、増幅された各細胞サンプルから2マイクログラムの二本鎖CD NAを標識し、ハイブリダイゼーション後に5マイクログラムのCY3標識サンプルをNimbleGen遺伝子発現アレイにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション後にスライドを洗浄して乾燥させ、イメージングできるようにします。分子デバイスの遺伝子を使用して、100 POWと300〜350 PMTに校正された設定のスキャナー4、200を選択します。

遺伝子チップを解析し、nimble genのnimble scanソフトウェアを使用して各アレイのペアファイルを生成し、データ解析を進めます。心臓のプロフェクト化に成功した場合、典型的な長方形の形態を保持した健康な心臓細胞の割合が高くなりました。もし滲出がうまくいかなかったら、多くの細胞が死んでいたでしょう。

細胞をWTA 2法で増幅し、最終製品の品質を試験しました。サンプルは、ナノドロップスペック分光計の読み取り値とバイオアナライザーチップからのエレクトロフェログラムの読み出しの両方で堅牢な増幅を示しました。要約すると、多くの遺伝子が心筋細胞で強力に発現していました。

しかし、QPCRデータにおけるナノ流体のサブセットからのピーク融解温度のヒートマップに見られるように、すべてのアッセイが同等に信頼性が高いわけではありません。このマップの各行は、43の別々のQPCRアッセイにおける1つの単一細胞サンプルを表しています。一部のアッセイは非常に変動性があり、PCR特異性が高いアッセイよりも信頼性が低い可能性があります。

この手順を完了するときは、事前に高品質の細胞を取得する必要があることを覚えておくことが重要です。これにより、下流の遺伝子発現プロファイリングの品質が保証されます。習得すれば、シングルセル単離手順は2時間半未満で完了し、これらの細胞からの遺伝子発現プロファイリングは2日未満で完了できます。