RNAiによる遺伝子ノックダウンと利尿アッセイネッタイシマカ蚊
2012年7月14日
このプロトコルでは、とRNAiによる遺伝子サイレンシングを組み合わせる利尿アッセイは蚊体液の排泄をしています。
このビデオプロトコルは、昆虫の特定の遺伝子をノックダウンし、排泄率を測定するための新しいバイオアッセイを実施する効果的な技術を示しています。本日ご紹介する技術は、RNAiを介した遺伝子ノックダウンとin vivo利尿アッセイを組み合わせたものです。これは、さまざまな港湾種の利尿を研究するために使用でき、実際には2つの異なる蚊種のアクアポリン水路の機能を研究するために開発されました。
今日お話しするプロトコルは、2つの部分に分かれています。最初のデモンストレーションでは、単純な蚊の注射装置を構築し、二本鎖RNAを準備して胸部の蚊に注入し、RNAを介した遺伝子ノックダウンを行う方法を示します。2番目のデモンストレーションは、RNAiを介した遺伝子ノックダウン、目的の遺伝子に対する特定のダブレット鎖RNAおよび制御されたダブレット鎖RNAが合成される最初のステップとして、インビボバイオアッセイを使用して蚊の排泄率を測定する方法を示しています 必要となる追加の機器と材料には、蚊の収集用の収集バイアルを備えた吸引器が含まれます。
細い先端の鉗子、CO2フライパッドは、必要に応じて光源の針引き手でフライパッド実体顕微鏡をきれいにするためにCO2ガスボトルエタノールにフックアップ。1ミリメートル刻みでマークされたガラス毛細管針、蚊を注射するためのマイクロインジェクター、注射後に蚊を入れる容器、および注射後の蚊の食物源(20%ショ糖、浸した綿球、水に浸したレーズンなど)。ハサミを使って簡易的なマイクロインジェクターを組み立てることができます。
金属針、ガラスキャピラリー、1ミリリットルの注射器、1ミリリットルのプラスチックピペットチップ、長さ約40センチメートルにカットされたチューブ。シリンジの針ハブの先端を0.2ミリリットルの目盛りでカットし、ゴム製のプランジャーヘッドを取り外しています。プランジャーヘッドに穴を開けるために金属針を使用します。
ガラスキャピラリーを穴に入れ、ヘッドをシリンジに戻します。次に、シリンジの先端をチューブの一方の端に配置し、1ミリリットルのプラスチックピペットチップをもう一方の端に配置します。これをマウスピースとして使用します。
あるいは、10ミリリットルの注射器を使用して、注射に必要な空気圧を生成することもできます。次に、ガラス製の毛細管針をゴム製のプランジャーヘッド穴に置き、針の先端を折って、液体が流れるのに十分な幅になるようにします。調製したD-S-R-N-A試料に注射針を浸し、マウスピースまたはシリンジで液体を吸引して液体試料を注射針に引き込みます。
電池式の吸引器で蚊を収集バイアルに集めます。バイアルにキャップをかぶせ、清潔なCO2パッドの上に置いて蚊に麻酔をかけます。あるいは、蚊を氷の上で麻酔することもできます。
注射プロセスを開始する前に、すべてのオスを捨ててください。CO2パッド上で羽根や絵筆を使って操作できます。怪我をしないように、鉗子で蚊の足や翼をつかみます。
最初の蚊を注射する準備ができたら、鉗子で針の先端を胸部の反対側に挿入して、胸部の片側を優しく支えます。キューティクルの薄い部分に注入し、針を胸部に深く押し込みすぎないようにすることをお勧めします。針が所定の位置に配置されたら、液体を蚊に吹き込みます。
二本座礁。RNAは血リンパ液に分散し、細胞に取り込まれて、標的ジーンズのRNA眼を介したノックダウンを引き起こします。注射後、蚊を容器に入れて保管します。
たとえば、1パイントのワックスライン、段ボールの蓋で固定されたメッシュカバー付きの段ボールカップ。すべての蚊が容器に入れられたら、容器を環境制御されたチャンバーに入れて孵卵し、蚊には20%のスクロース、石鹸、綿球などの食料源をメッシュカバーの上に置く必要があります。昆虫利尿は、近年の単純な研究モデルシステムとして魅力的な研究者です。
RNAiのような技術は、分子レベルでの利尿を研究するために使用できます。このビデオで紹介されている手法は、in vivoで利尿を研究する簡単な方法を提供するはずです。メスの蚊はPBSバッファーを注射してから2分以内に尿を排泄し始めるため、排泄を開始する前に体重を測定することが重要です。
このプロトコルの第2部では、ジェダイの蚊に対してin vivo利尿アッセイを行う方法を示します。ノックダウンプロトコルでは必要とされなかったが、このプロトコルで必要となる追加の材料や機器、RPBS緩衝液と重量測定を行うための分析精度天びんは、天びんは10ミリグラムの精度でなければならない蚊の記録の収集前に、分析精度天びんを使用してキャップ付きの空の収集バイアルの重量。このバイアルは、その後のすべての測定に使用されます。
蚊の入ったバイアルをキャップを精密天びんに置いて、5人の女性の初期体重測定を行います。5匹の雌の蚊に麻酔をかけたら、マイクロインジェクターでアクセスしやすいように、CO2パッドに蚊を並べる必要があります。針を胸部に挿入すると、PBSバッファーを蚊に吹き込みます。
注射後、蚊をコレクションバイアルにそっと入れ、キャップをします。注入された5匹の蚊の最初の重量測定を行うには、キャップ付きのフィールドコレクションバイアルを精密天びんに置きます。5匹の蚊のグループの重量は、キャップ付きのフィールドコレクションバイアルの重量を取り、キャップの重量で空のコレクションバイアルの重量を差し引くことによって計算できます。
蚊の測定は30分間隔で行う必要がありますが、排泄率に応じて、これを短い間隔またはより長い間隔に調整できます。30分後、吸引器で5匹の蚊のグループをキャップ付きの同じ収集バイアルに集めます。次に、キャップ付きのフィールドコレクションバイアルを精密天びんに置いて、次の重量測定を行います。
利尿アッセイは、ADA aegyptiとkyx ktiの2種類の蚊を使用して、異なる温度で実施されました。注射後最初の1時間の排泄率はパーセンテージで与えられます。グラフは、温度が上昇するにつれて利尿が強く増加することを示しています。
また、2つの蚊の種間で排泄率に違いがあることも観察されました。ここで紹介するin vivo利尿アッセイには、幅広い将来のアプリケーションがあります。RNAIのようなリバースジェネティクス法に加えて、シグナル伝達阻害剤などの昆虫利尿に対する薬物の影響を研究するために使用できます。
また、ターゲットインスタンスでのxeno Bioticクリアランスのプロセスを研究するための強力なアッセイでもあります。
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概要
このプロトコルは、RNAiを介した遺伝子サイレンシングと生体内の利尿アッセイを組み合わせた技術を実証し、蚊の体液排泄に対する遺伝子ノックダウン効果を研究します。この方法は、異なる蚊種におけるアクアポリン水チャネルの機能を調査するのに特に有用です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- 昆虫学
背景
- RNA干渉（RNAi）は遺伝子サイレンシングの強力なツールです。
- 利尿アッセイは昆虫の体液調節に関する洞察を提供できます。
- アクアポリンは様々な生物における水の輸送に重要です。
- この研究は、疾病伝播において重要な蚊に焦点を当てています。
研究目的
- 蚊の体液排泄における特定の遺伝子の役割を調査すること。
- 生体内アッセイを使用して遺伝子機能を評価する方法を開発すること。
- 蚊における水チャネルメカニズムの理解を深めること。
使用された方法
- RNA伝達のための蚊注射装置の構築。
- 二重鎖RNAの蚊の胸部への準備と注射。
- 排泄率を測定するための生体内利尿アッセイの実施。
- 遺伝子ノックダウンのための特定および対照二重鎖RNAの合成。
主な結果
- RNAi技術を用いて遺伝子ノックダウンが成功裏に達成されました。
- バイオアッセイにおいて排泄率が効果的に測定されました。
- この方法は蚊の様々な遺伝子を研究するための可能性を示しました。
- このアプローチを通じてアクアポリンの機能に関する洞察が得られました。
結論
- RNAiと利尿アッセイを組み合わせた方法は遺伝子機能研究に効果的です。
- このプロトコルは他の昆虫種にも適用できます。
- 体液調節における遺伝子役割の理解は、ベクター制御戦略に情報を提供できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
RNAi-mediated gene knockdown combined with in vivo diuresis assays enables precise interrogation of gene function in disease-vector mosquitoes, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. Quantitative excretion measurements provide actionable data for evaluating gene roles in fluid regulation, directly informing vector biology and potential intervention strategies. This approach strengthens predictive confidence at the discovery inflection point for vector control and insect physiology research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of candidate genes involved in fluid regulation pathways.
- Supports mechanistic de-risking by linking gene knockdown to physiological outcomes.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of aquaporin and transporter targets.
- Provides quantitative data to inform portfolio triage and prioritization.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated in vivo assay system for measuring excretion rates post-gene knockdown.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for comparative analysis across gene targets.
- Enables standardization of assay conditions for downstream screening of modulators or inhibitors.
- Supports scalability and platform reuse for broader gene function studies in arthropods.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling fluid regulation in blood-feeding vectors.
- Provides translational continuity from gene function discovery to preclinical vector control strategies.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative physiological readouts.
- Supports mechanistic insights into xenobiotic clearance and drug effect studies in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early gene function interrogation through assay development and preclinical vector biology research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for fluid regulation genes.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative excretion measurements for reliable condition comparison.
- Analytics: Provides statistical outputs on excretion rates, enabling robust cross-condition analysis.
- Translational Research: Connects gene knockdown effects to disease-relevant physiological endpoints in mosquitoes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for gene function and pharmacological studies in arthropod models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Promotes assay standardization, reproducibility, and scalability across research teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vector biology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNAi design, insect handling, and quantitative bioassays.
- Needs access to microinjection equipment, analytical balances, and controlled environmental chambers.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and measurement intervals.
- Adaptation may be needed for different insect species or physiological endpoints.
- Precision in timing and measurement is critical to ensure reliable excretion data.
