Name: 培養皿内の機能モーターユニット：脊髄外植片と筋細胞の共培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: 学ぶ ラット胚脊髄外植片とヒト原発筋細胞の共培養による機能的モーターユニットの作製法。神経支配と筋分化のin vitroモデルを確立し、神経筋接合部の研究や疾患モデリングに応用可能です。

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私たちの仕事は、スイス国立科学財団（SNF）、システム生物学（SystemsX.ch）、筋ジストロフィー協会アメリカ（MDA）、協会·フランセーズcontreレミオパシー（AFM）、米国ミトコンドリア病財団、スイスのイニシアティブによってサポートされています（UMDF）、ゲーベルト-RUF財団まれな疾患プログラム（GRF）、筋疾患（SSEM / FSRMM）、スイスライフ &quot;JubiläumsstiftungエリーゼVolksgesundheitウントmedizinische Forschung&quot;、ロシュ研究財団と大学の研究のためのスイス社会バーゼルの。

1。初代ヒト筋細胞培養の準備<ol><li>植-RE-植技術を4に記載のヒト筋細胞の培養を確立します。最初に、生検から非筋肉組織を除去する。その後、線維芽細胞は外植片から出てくることができ、プラズマの凝塊で1 mm 3で 、筋肉の外植片を、埋め込 ​​むことができます。 </li><li>埋め込まれた外植片は、プラズマゼラチンコートしたディッシュに移し、それらを通常の成長培地（MEM、25％の培地199、10％ウシ胎児血清[FBS]、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、10μg/ mlのインスリンを補足に成長させてい単分子層では10 ng / mlのヒト上皮成長因子[EGF]、12.5 ng / mlのヒト線維芽細胞成長因子[FGF]）。これらの条件の下で外植片から出てくる細胞は筋肉細胞である。これらの細胞は、外植片を除去した後、単層で成長していきます。 </li><li>文化aneurally通常の成長培地に0.1％ゼラチンコートプレート上で細胞。細胞はすることができますaneurally培養し、必要に応じて増幅した。これは、共培養を行うために3と8の間の通路で筋細胞を使用することをお勧めします。それは若い筋管を支配することが重要であり、このポイントの後、共培養は失敗のリスクが高い。さらに、筋管が大きすぎると厚すぎてはいけません。 </li><li>神経支配が予定されている2日前、プレート、通常の増殖培地中皿当たり500,000個の細胞の密度で35mmの組織培養皿（または6ウェルプレート）の筋細胞。その密度で、細胞は次の日に核融合を開始するための適切なコンフルエントに、その後の神経支配でその翌日である。これらの条件を使用して、筋管では、最適な支配、したがって、その後の繊維の収縮のために右の段階にある。 </li><li>次の日に、25％の培地199、5％FBS、10μg/ mlのインスリンおよびペニシリン/ストレプトマイシン、1％を添加したMEMで構成される融合培地で通常の成長培地を交換してください。 </li></ol> 2。 Isolati<html>ラット胚脊髄外植片の上に脊髄外植片を分離するために全体の手順は、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むハンクス平衡塩溶液（HBSS、GIBCO / Invitrogen社REF 14170）で、双眼顕微鏡下で実行されます。 <ol><li>さまざまな開発段階では全体の手順を危うくするとして、それは、ラットの胚はED 13と14の間にあることが重要です。 CO 2を妊娠女性を犠牲にしてHBSS培地中の全胚チェーンを収集します。それぞれの胚を分離し、安楽死のためにそれらを首をはねる。 </li><li>ワンピースの身体の残りの部分から胚脊髄の解剖とその周辺の筋肉や結合組織を除去します。機能的な神経支配を確保するため、脊髄に接続された後根神経節（DRGS）を保つために非常に注意してください。 </li><li>各植は、少なくとも2 DRG（1 mm 3の外植片）それに接続が含まれている方法で、横方向に各脊髄のスライス。 </li></ol><html>ラット胚脊髄外植片を持つ人間の筋肉細胞のove_title &quot;&gt; 3。神経分布<ol><li>単層上に媒体の微細な層を残して、筋肉の細胞培養に融合培地を除去します。 </li><li> 、筋細胞層の上に慎重に35mm皿あたり5つ等間隔に植片を外植片を配置します。 </li><li>非常にゆっくりと追加し、各植に賢明な、融合培地をドロップします。それは植が最初に付着し、細胞と接触するのを許容する生き残るために筋細胞用培地を追加する必要がありますが、あまりにも多くはありません。媒体が（あまりにも強く、またはあまりにも多くのメディア）が正しく追加されていない場合、外植片をフロートされ、筋細胞を支配するために失敗します。 </li><li>外植片が付着し始めたら、35 mmディッシュあたり2 mlに融合培地を上回ると、インキュベーターに戻す非常に慎重に皿を置く。 </li></ol> 4。異種神経筋共培養のメンテナンス<ol><li>週二回の融合培地を変更します。 </li></ol>_title &quot;&gt; 5。代表的な結果できるだけ早く二日として支配した後は、各外植片から新興国やボタンのような構造（ 図1）で表される筋細胞との接触を確立する突起を見ることができます。 早くも支配した後4-6日として、いくつかの個々の繊維は、契約を開始します。 収縮は週二回培地を変更するだけで維持され、何ヶ月も持続する。 約2週間後、脊髄片自体が退化したが、神経支配が保存されている。これは正常です。神経成分の微細な層は、筋細胞の層の表面にとどまります。この神経ネットワークは、モータユニットの機能を維持するのに十分である。 外植片は、神経支配の翌日培地に浮遊した場合、それらが付着することはありません。筋細胞の層がある場合にこの現象が発生した十分にコンフルエント場合、またはメディアがあまりにも大まかに追加されません。時には、植付着がない突起が出現します。これはおそらくそれに接続されているDRGの欠如によるものである。その場合においても、神経支配は確立されません。外植片は、まだ簡単に切り離すことができますように、最初の週は非常に慎重に料理を操作します。融合メディアを交換するために、細胞の剥離を避けるために最小限の速度で液滴を追加します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3616/3616fig1.jpg" /> 図1脊髄外植片筋細胞共培養1日目から15日まで。

<ol><li>Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myotube+differentiation+in+vitro+in+different+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions.</a> Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).</li>
<li>Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+muscle+cultured+in+monolayer+and+cocultured+with+fetal+rat+spinal+cord%3A+importance+of+dorsal+root+ganglia+for+achieving+successful+functional+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation.</a> J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).</li>
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<li>Askanas, V., Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+program+for+investigating+adult+human+skeletal+muscle+grown+aneurally+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture.</a> Neurology. 25, 58-67 (1975).</li>
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<li>Durbeej, M., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophies+involving+the+dystrophin-glycoprotein+complex%3A+an+overview+of+current+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models.</a> 12, 349-361 (2002).</li>
<li>Schnabel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience%3A+Standard+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroscience: Standard model.</a> Nature. 454, 682-685 (2008).</li>
<li>Benatar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%3A+treatment+trials+in+the+SOD1+mouse+and+in+human+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS.</a> Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).</li>
<li>Dorchies, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+innervation+and+differentiation+of+X-linked+myotubular+myopathy+muscle+cells+in+a+nerve-muscle+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system.</a> Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).</li>
<li>McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+innervation+of+cultured+human+muscle+overexpressing+betaAPP+experimentally+and+genetically%3A+relevance+to+inclusion-body+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies.</a> Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

筋細胞の培養は、通常、複数の細胞および細胞型接続の重要性を再現していないため、正常および病理学的文脈において筋細胞の機能を研究する生理学的なin vitroのツールは 、myologistsの最重要である。筋細胞に運動ニューロンの精製加えてシュワン細胞の存在は、5効率的に神経支配のために必要とされ、それに関連するプロトコルがここで説明する（3D +特殊なディストリビューション）を位相的にしていないので、機能的なモータユニットを達成するために十分ではありませんin vitroでかつ容易に評価することができ、完全なNMJの成熟の結果で神経支配筋細胞を確立するために首尾よく使用されてきました。 マウスモデルは、多くの神経筋疾患で利用可能になりました。残念ながら、これらのモデルの多くは、脊髄性筋萎縮症のマウスモデルでは、デュシェンヌ型、例えば、ヒト患者の病気への翻訳の面で制限されています筋ジストロフィーや筋萎縮性側索硬化症。脊髄性筋萎縮症は、部分的にヒトゲノム6の第二...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 14170 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 31095 </td></tr><tr><td>培地199 </td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 31153 </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>胎児のクローンPerbio </td><td> SH30066.03 </td></tr><tr><td> Insuline </td><td>シグマ</td><td> I9278 </td></tr><tr><td>ヒトEGF </td><td>シグマ</td><td> E9644 </td></tr><tr><td>ヒトFGF </td><td> SiのGMA </td><td> F0291 </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン溶液</td><td>ギブコ</td><td> 15140 </td></tr></tbody></table>

培養皿内の機能モーターユニット：脊髄外植片と筋細胞の共培養

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

神経成分の存在下で、細胞の分化が制限されており、運動ニューロンの刺激は、1が欠落している自発的に、ためにヒト初代筋細胞は単層でaneurallyまれに契約を培養した。これらの制限は、培養筋細胞の多くの神経疾患のin vitroでの研究を妨げる。重要なのは、単層、培養筋細胞の実験的な制約は、共培養における脊髄外植片と筋線維の機能的神経支配によって克服することができます。 ここでは、Askanas 2によって開発された方法に従って、差別化と繊維の収縮を完了するには、リード、ヒト初代筋細胞の効率的、適切な神経支配を達成するために必要な様々なステップを示しています。これを行うには、筋細胞はまだ脊髄スライスに接続された後根神経節で、ED 13.5でラット胎児の脊髄外植片と共培養されています。数日後、筋肉のfibers契約を開始し、最終的には筋細胞への接続という脊髄外植片から突出した機能的な神経によって支配によって横紋になる。この構造は、単に培養液の定期的な交換によって、多くのヶ月間維持することができます。 それは人間の筋肉の発達と神経支配の学際的な分析のための機能モデルを表して、この非常に貴重なツールのアプリケーションは、たくさんあり​​ます。実際には、完全なde novoの神経筋接合部のインストールは、基本的および生理学的文脈では、各ステップで多くのパラメータを簡単に測定できるように、培養皿で発生します。 ほんの一例、ゲノムおよび/またはプロテオミクス研究を引用する共培養上で直接実行することができます。両方のコンポーネントが別の種から来るので、さらに、プリ·ポストシナプスの効果が具体的かつ個別に、神経筋接合部で評価することができ、ラットとヒトであった。神経筋の共培養はまた、筋肉や神経筋疾患3から患っている患者から単離されたヒト筋細胞で行うことができるため、候補薬剤のスクリーニングツールとして使用することができます。最後に、特別な機器が、通常のBSL2施設は、培養皿の中で機能的なモータユニットを再現する必要はありません。このメソッドは、このように、正常および疾患のコンテキストで、筋肉だけでなく、神経筋機能の生理学的および機構の研究のための神経の研究コミュニティの両方の価値があります。

培養筋細胞は、神経支配のある筋を再現するために不十分なモデルである<emin vivoでの&gt;</em&gt;。機能的なモータユニットを再現することができます<em&gt; in vitroで</em&gt;ラット胚脊髄の外植片を用いて分化したヒト初代筋細胞の神経支配によって。この資料では、脊髄の外植片と筋細胞の共培養が確立されている方法について説明します。

単層で非神経性に培養されたヒト初代筋細胞が自発的に収縮することは稀である。なぜなら、神経成分が存在しない状況下では、細胞...

この手順の全体的な目的は、in vitroで機能的な運動単位を再現することです。これは、ヒト初代筋細胞をラット胚から分離した脊髄外植片と共に培養することで達成されます。その後、外植片を付着させたまま、脊髄インプラントにヒト筋細胞を神経支配させます。筋細胞が完全に分化するまで、培地を用いて慎重に給餌を行います。その後、分化した筋細胞の分子および細胞表現型を、選択した分子生物学的ツールを用いて評価することができます。この手法を視覚的に提示することは極めて重要です。なぜなら、まず脊髄の単離方法を習得することが困難であるためです。そして何よりも、培養基を革新的な筋肉細胞に添加する際は、非常に慎重に行う必要があります。胚齢 ED 12.5 から ED 13.5 の間の胚を持つ妊娠ラットを安楽死させます。ステージが全工程において極めて重要であるため、正確に確認してください。実体顕微鏡下で、10% FBS含有HBSS中にて子宮を摘出し、胚の連鎖をすべて回収します。個々の胚を分離し、脱頭を行います。脊髄をひとまとめに単離し、周囲の筋肉および結合組織を除去します。まず、マイクロシザーを用いて胚を固定します。脊髄の両側に切り込みを入れ、慎重に皮膚を剥離します。次に、胚を横向きに置き、後根神経節（DRG）が付着したままの状態で、脊髄を慎重に単離します。DRG（後根神経節）が脊髄に付着したままでなければ、機能的な神経支配は起こりません。脊髄は、周囲のピンク色の結合組織や筋肉よりも白い色をしています。DRGを傷つけないように注意しながら、周囲の組織を除去してください。単離後、マイクロシリンジの針を用いて、各脊髄を、少なくとも2つのDRGが付着した立方体状に横断的に切断します。これらの切片は約1 mm³の大きさになり、標準的なヒト筋細胞培養との共培養が可能な状態となります。本プロトコルでは、組織生検から培養したヒト筋細胞が必要となります。この手順の詳細については、書面によるプロトコルを参照してください。まず、筋細胞培養液から融合培地を除去し、単層上に薄い培地層を残します。次に、x explanを筋細胞の上に慎重に配置します。5つのX外植体をごく等間隔に、各35 mmディッシュ上に配置します。各X外植体に、融合培地をゆっくりと滴下してください。融合培地を急いで加えたり、過剰な量を加えたりしないでください。そうしないと、xの外植片が浮遊し、筋細胞への神経支配がなされません。その後、非常に注意深くディッシュをインキュベーターに戻します。ゆっくりと培地を追加し続けてください。慎重に取り扱えば、x個の外植片は約1時間で培地中での浮遊を停止し、細胞に接着します。接着後、融合培地の量を35 mmディッシュあたり2 mLに増やします。一晩待ってもX外植片が依然として培地中に浮遊している場合は、筋細胞層のコンフルエンシーが不十分であったか、あるいは培地が添加された可能性があります。おおよそ2回です。これらのX explanは、週に2回の頻度では決して定着しません。細胞の剥離を防ぐため、すべての融合培地を非常にゆっくりと滴下して交換してください。Xの explan は最初の1週間は非常に脆弱であり、剥離しやすいため注意が必要です。この手法の非常に優れた点は、接種後、培養液を測定または回収するだけで、共培養系のオーム解析が可能であることです。また、分子ツールを慎重に選択することで、筋肉由来のものと神経由来のものを区別して検出することができます。神経支配が始まって2日後、各外植片から神経突起が伸展し、ボタン状の構造として表される筋細胞との接触を確立します。神経突起が伸展しない場合、おそらくDRGの付着不足により、神経支配は失敗します。神経支配後早ければ4日から6日で、少数の個別の筋繊維が収縮し始めました。収縮は数ヶ月間持続し、単に培養液を週2回交換することで維持されました。予想通り、約2週間後には脊髄外植片自体は変性しましたが、神経支配は保持されていました。筋細胞層の表面に神経成分の薄い層が残り、この神経ネットワークが運動単位の機能を維持するのに十分な役割を果たしていました。この手法の大きな利点の一つは、患者からサンプルを採取し、対照群と患者サンプルの共培養における表現型を測定または比較できることです。また、この手順に従うことで、リアルタイムPCRやウェスタンブロッティング、免疫組織化学などの非常に一般的で古典的な手法を用いることができ、共培養における筋肉または神経の表現型を実際に研究することが可能です。

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