幹細胞培養アプリケーションのための3Dフィブリン足場の調製

この手順の全体的な目標は、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞を含む多能性幹細胞を培養および分化するための3Dフィブリン足場を調製することです。これは、最初にフィブリノーゲン溶液を作成し、それらを一晩透析して重合を阻害する分子を取り除くことによって達成されます。手順の第2ステップは、24ウェル組織培養プレートの各ウェルでフィブリンの底部ベース層を重合することです。

手順の3番目のステップは、シードすることです。単一胚体は、多能性幹細胞から足場のベース層に誘導され、続いてフィブリンの第2層が追加されて完全にカプセル化されます。手順の最後のステップは、適切な細胞培養培地をスキャフォールドに追加することです。

アプリケーションによっては、最終的には、多能性幹細胞に由来する胚体を生体材料ベースのスキャフォールドである3Dフィブリン内で成功裏に培養できることを示す結果を得ることができます。従来の2D細胞培養法と比較した場合のこの手法の主な利点は、幹細胞の挙動を3次元で観察および操作できることです。この方法は、幹細胞の挙動に影響を与える化合物や成長因子などの因子をスクリーニングすることにより、幹細胞生物学に関する重要な質問に答えるのに役立ちます 3D微小環境では、フィブリノーゲンは血液由来のタンパク質であるため、取り扱い前に適切な安全トレーニングを完了する必要があります。

まず、凍結乾燥フィブリノーゲンを冷蔵庫から取り出し、室温になるまで20分間放置し、各35ミリメートルのペトリ皿に3ミリリットルのトリス緩衝生理食塩水を加えます。約100〜130ミリグラムのフィブリノーゲンを計量し、各皿のTBSの表面に振りかけます。フィブリノーゲンが溶液に入り始めるまで5分待ちます。.

次に、ペトリ皿に蓋をします。ペトリ皿を摂氏37度で2時間インキュベートして、フィブリノーゲンが完全に溶液に入るようにします。次に、TBS付き湿式透析チューブは、チューブの下端を折り、透析クランプで端を閉じ、皿からのフィブリノーゲン溶液を透析チューブにピペットで固定します。

次に、上端を折り返して、透析クランプで閉じます。フィブリノーゲン溶液の入った透析チューブをTBSの4リットル容器に入れ、溶液を混合します。

低速に設定された攪拌板を使用して、溶液をプレート上で一晩少なくとも12時間透析します。Tb溶液は、滅菌組織培養フードの下でこの時間に交換する必要はありません。透析チューブからフィブリノーゲン溶液を取り出し、円錐形のチューブに入れます。

5ミクロンのシリンジフィルターでフィブリノーゲン溶液をろ過し、溶液中の大きな不純物を除去します。次に、ポイント22ミクロンフィルターを使用してろ過し、フィブリノーゲン溶液を50ミリリットルの円錐管に滅菌します。総体積を決定した後、280ナノメートルでフィブリノーゲン溶液の吸光度を測定し、1未満の吸光度を得るためには、50の希釈係数がしばしば必要になります。

ブリノーゲン溶液中に存在するタンパク質の濃度を次の式を使用して計算します。ここで、ミリグラム/ミリリットル単位のフィブリノーゲンの濃度は、希釈係数の2 80倍を1.55で割ったものに等しく、1.55はヒトフィブリノーゲンの2 80の吸光係数です。次に、初期容量に基づいて、溶液の濃度をフィブリノーゲン1ミリリットルあたり11.1ミリグラムに希釈するために必要なTBSの量を計算します。フィブリン足場中のタンパク質の最終濃度は、1ミリリットルあたり10ミリグラムになります。

重合後、24ウェルプレートの1列目の各ウェルの右側に40単位/ミリリットルのトロンビン溶液を15マイクロリットル加え、次に各ウェルの左側に50ミリモルの塩化カルシウム溶液を15マイクロリットル加えます。さて、最後に270マイクロリットルのフィブリノーゲン溶液をプレートに加えます。プレートを左右に、そして後ろから前に振って、溶液を混ぜます。

混合物を含む列を5分間重合させます 室温で、足場は重合するにつれてより不透明になります 重合したフィブリノーゲンの列を一度に1つずつ作り続けます 所望の数のフィブリン足場が得られるまで。最後の5分間のインキュベーション後、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートし、足場を完全に重合させます。1時間のインキュベーションが終了したら。

20マイクロリットルのピペットマンを使用して個々の胚体を選択し、それをフィブリン足場の中心に置くことにより、足場に種をまきます。顕微鏡で、各ウェルに1つの胚体が含まれていることを確認します。各胚体の上に5マイクロリットルのトロンビン溶液と50ミリモル塩化カルシウム溶液の5マイクロリットルを追加し、続いて各ウェルに90マイクロリットルのフィブリノーゲン溶液を追加すると、溶液は胚体をカプセル化する気泡を形成する必要があります。

プレートを摂氏37度でさらに1時間インキュベートしてインキュベーション後の重合を確保し、各ウェルに適切な細胞培養培地を1ミリリットル加え、プレートを摂氏37度のインキュベーターに戻します。ここでは、マウス胚性線維芽細胞フィーダー層上で培養したマウス人工多能性幹細胞の代表的な画像を示します。8日間のレチノイン酸処理プロトコルを使用して、細胞は、ここに示すように神経前駆細胞を含む細胞の凝集体である胚体を形成するように誘導されます。

この図は、3Dフィブリン足場内で3日間培養した後のIPS由来の胚体の外観を示しています。同様の結果は、以前にマウス胚性幹細胞を用いて得られた。このビデオを見た後、この2日間のプロセスを使用して胚体を3Dフィブリン足場に播種する方法を十分に理解しているはずです。

フィブリノーゲンの取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、個人用保護具の着用や適切な廃棄物処理などの適切な予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。