Name: Cryoinjuryを使用した大人のゼブラフィッシュにおける心筋梗塞の誘発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学ぶcryoinjury法による成体ゼブラフィッシュの心筋梗塞誘発と心臓再生機構。組織学的解析と免疫蛍光法を用いて、心筋細胞増殖と組織修復の分子メカニズムを詳細に解明する方法です。

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私たちは、優れた技術支援のために、魚のケアのためのV. Zimmermann氏に感謝します。 310000_120611：この作品は、スイス国立科学財団、助成番号によってサポートされていました。

1。機器のセットアップ<ol><li> cryoinjuryを実行するために使用される主なツールは、クライオプローブ、ステンレス鋼（ 図1A）で作られてペン状の器具のことです。円筒形のハンドルは長さ40ミリメートルで、8ミリメートルの直径を有する。アプリケーターの先端は6長さmm、直径0.8 mmである。先端とハンドルの間の接合部は長い円錐形の4ミリメートルです。さらに、クライオプローブのハンドルは、手順の中でツールを保持しながら、指の凍傷を避けるために、プラスチックチューブ、テープで絶縁する必要があります。 </li><li>凍結手術に必要な他の材料は実体顕微鏡、鋭いピンセット、ミクロ解剖春のはさみやプラスチックピペットです。さらに、魚や魚を転送するためのプラスチックスプーンを麻酔用ビーカーを準備します。 </li><li>手術中に、魚は、その腹側のアップ（ 図1B）と湿ったスポンジに配置されています。 、安定した手順で動物を保​​持する適切な溝は、手動でスポンジにカットする必要があります。 </li><li>手術後に魚を転送するために、システムの水タンクを準備します。 </li><li> 10秒カウントダウンして、自動的に24秒のカウントダウンで最初の二重タイマーを設定します。 </li></ol> 2。 Cryoinjury手順<ol><li>少なくとも3分間液体窒素の3-5 cmの先端部を浸漬することにより、クライオプローブの冷却。 </li><li>魚はその背中をオンにし、その鰓がほとんど（約90秒）の移動が停止するまで0.02パーセントtricaineでそれをimmergingで大人のゼブラフィッシュを麻酔。 </li><li> （ 図1B）逆さまに魚を保持するためにカットされている湿ったスポンジにプラスチックのスプーンで魚を転送します。非利き手を用いた鉗子でしっかりと魚を保持します。視覚的に心臓の後内側縁を見つけて、穿刺肌をまっすぐに虹彩切除術のはさみを使用しています。 （ 図1C）。 </li><li> cuで心臓の上に小さな（約2 mm）の切開を行う皮膚、筋肉（ 図1D）ストレート前方にtting。これは動物を殺すように、骨の鰓装置を介して切断しないでください。 </li><li>優しく叩い心室への直接アクセスを持っているハサミの先端で皮下の銀色の上皮層（ 図1E）を引き裂く。この意志穿刺中心として、体腔内に深くはさみを入れないでください。心臓の鼓動はよく見えるべきであり、広範な出血は開胸術（ 図1F）中に発生するべきではありません。 </li><li> 24秒、続いて10秒に設定されているプログラムタイマーを起動します。 10秒間液体窒素からクライオを取り出します。軽く振ってクライオにはより多くの窒素が存在しないことを確認してください。胸（ 図1F）を開くために鉗子を用いて横方向に切開を広げた。 </li><li> PRの先端を心室タイマーが鳴る10秒に1回、すぐに触れなく優しく電子冷却クライオ（ 図1G）。 </li><li> 24秒タイマーが鳴るしたら、組織からクライオを解放し、システムの水をタンクに魚を転送するために胸の上にプラスチック製のピペットを使用して、システムの水の2-3 mLを注ぎます。 </li><li>魚は数秒後に呼吸を再起動する必要がありますし、それは、水泳を再開する必要があります。それは約45秒後に息をしない場合は、それ自体が呼吸を開始するまで、プラスチック製のピペットを用いて鰓に水を噴出することによって動物を刺激する。我々の経験では、魚の95％が手術を生き残る、すべての死亡は手術の日に発生します。それは切開を縫合する必要はありません。 </li></ol> 3。ハートコレクションおよび固定<ol><li>心臓、二つの鉗子、マイクロ解剖はさみと湿った溝スポンジを固定するためのマイクロ遠心チューブにホルマリン2％の1 mLを準備します。 </li><li> cryoinjury後、選択された日で、5分間、0.1％tricaineの魚を安楽死させる。 </li><li>配置まで湿った、溝スポンジに魚腹側。ミクロ解剖ハサミで鰓軟骨を介して心臓、上記大（約4 mm）の切開を行います。鉗子（ 図1H）で広く切開を開きます。 </li><li>動脈球、心室の前方に白い構造（ 図1 HI）をピンチオフし、それを引いて空洞から心臓を削除します。全体の解剖心臓は図1J、図2Aに示されています。 </li><li>ホルマリン2％1mlのマイクロ遠心チューブに3心まで置きます。穏やかにチューブを数回回して4℃で一晩おく℃、 </li></ol> 4。マウントハート<ol><li> 5分間、PBS中の心を洗い流してください。 4℃で予冷されるべき30％ショ糖の10 mLに心を移し、軽く混ぜ合わせます。試料は最初にショ糖溶液の表面に浮く必要があります。 4℃で1時間20分間インキュベーションを続ける後のこの時間は、心がチューブの底に沈んでしまう。 </li><li>ドライアイスボックスを準備します。埋め込み型を取り、金型の下部10月封入剤の5mmの層を注ぐ。 </li><li>鉗子でOC Tは金型内でメディアをマウントするに心を置きます。実体顕微鏡下で、モールドの底部に心室尖部を達成するために、試料の向きを調整し、動脈球上に向かって。 </li><li>ドライアイス上で検体と金型を配置します。封入剤は、凍結を開始したときに、OCT培地で金型の残りの部分を埋める、それが完全に凍結しましょう​​。セクショニングの前に-80℃で少なくとも1時間金型を保持します。凍結検体は-80℃で何ヶ月も保存することができます</li></ol> 5。セクショニングハーツ<ol><li> 16μmのカットサイズ、-24°Cの槽内温度と-22℃で試料の温度とクライオスタットを設定します。 </li><li>で凍結ブロックを置きクライオスタットの試料ブロックの底面に平行に切断を開始し、その方向を修正します。 </li><li> 1ブロック当たり6 Superfrostプラススラ​​イドを準備し、1から6にそれらを列挙する。組織に到達するまで、切断を開始し、黒人と検体の周りにブロックをトリミングします。 </li><li> 6を入手するには1心の複製され、スライド1の最初のセクションでは、スライド2番目のセクションは、スライド3の3分の1を取るなどしたら、スライド6の第六セクションを配置し、スライド1で再起動するまで継続する臓器全体がカットされます。スライドの周りに8つのセクション（ 図3）の2つの行を収集します。 </li><li>室温で1時間スライドを乾燥させます。 -20℃で密閉ボックスに1年間までできるように保管しておきます</li></ol> 6。代表的な結果このプロトコルは、以下の代表的な心臓の損傷は、4 dpci（; 図2D-F日後cryoinjury）で解剖し、全体の心の中に示されています。 vにin vivoでの心筋組織をisualize、我々は、心臓特異的cmlc-2プロモーター11,12の制御下でEGFPと核DsRed2を発現するトランスジェニック魚を使用していました。 EGFPおよびDsRed2の蛍光シグナルの不在は、頂端 - 側脳室壁に沿って円盤状の梗塞ゾーンを画定。 組織の細胞および分子解析を実行するために、心は、固定およびクライオスタットで切片。横断心臓部の連続したシリーズの代表的なスライドは、 図3に示します。 セクションは、さまざまな方法（ 図4）で分析することができます。瘢痕に対する心の再生の程度を決定するために、我々は、差動、心臓および線維組織9ラベル酸性フクシンオレンジ-G（AFOG）染色を使用して、組織学的分析を行った。遺伝子発現解析は、in situハイブリダイゼーションの手順でに従って達成されました<suP&gt; 13。マーカータンパク質の分布を検出するために、我々は特異的な抗体9と蛍光抗体法を適用した。多様な染色手順の組み合わせは、心臓の再生は、次のcryoinjuryに関与する分子·細胞メカニズムの特定につながる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig1.jpg" /> 図1成体ゼブラフィッシュにおける心室のcryoinjuryを誘導する。クライオプローブの（A）の写真。 （B）大人のゼブラフィッシュは、その腹側を上にしてスポンジのスリットに配置されます。心臓にアクセスするには、（CF）胸部切開。 （C）皮膚と筋肉を通して小さなカットが2鰭（赤線）の間で行われます。 （D）はさみは、赤い矢印は、次の皮膚を切るために切開に挿入されます。 （E）皮膚の下に、銀色の皮下組織の薄い層（青破線で囲まれた）静かに心にアクセスするために開かれます。 （F）切開で広がっている鉗子や泡立て心室（緑の矢印）がcryoinjuryのアクセスが可能です。 （G）コールドクライオは、優しく心に触れることを胸に挿入されます。 （HJ）ハートコレクション。 （H）長く深い切開を心膜腔にアクセスするために胸部の鰓弓を介して行われます。二つの心臓の構造が表示されている：動脈球（白矢印）と心室（緑の矢印）。 （I）動脈球は、鉗子で保持し、体腔から引き出されています。 （J）心臓全体は、体のから切除されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig2.jpg" /> 図2代表的な制御とEGFPと心筋細胞の核DsRed2を発現大人のトランスジェニックゼブラフィッシュから解剖cryoinjured心。 （AC）の心を無傷。 （A）暗視野照明では、心室（V）、心房は心室にリンクされていた動脈球の（Ba、白）とバルブ（Va）を示​​しています。 tの（BおよびC）蛍光イメージ<html>彼そのまま心室表示EGFPと心筋細胞のDsRed2の発現。 （DF）ハートは4日後cryoinjuryで（4 dpci）（D）暗視野照明は、円盤状の梗塞（黄色の破線）を明らかにする。 （EF）心筋マーカーEGFPおよびDsRed2は、損傷を受けた心筋の（破線で囲まれた）を示す、梗塞領域で検出されません。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig3.jpg" /> 図3心臓のセクショニング。心臓の上部に向かって心（1および2、赤）（緑の3と4）の下部から横断切片の描画の（A）心臓全体。 （B）AFOG（酸性フクシンオレンジ-G）で染色した連続した横方向のセクションで一連のスライドの写真。最初のセクションでは、（1および2、赤四角）心室尖部が含まれており、心臓（3と4、緑色の四角）の最後のセクションでは、動脈球構成されています。 iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg &quot;/&gt; 図4の7日後cryoinjuryで心臓のセクションで実行解析の例。オレンジ色の（A）AFOG（酸性フクシンオレンジ-G）染色ラベルの健康な筋肉細胞、赤、青とフィブリン、コラーゲンを含む瘢痕組織。 （B） 心室ミオシン重鎖（vmhc）mRNAのin situハイブリダイゼーションでは、無傷の心筋（青染色）を可視化。負傷した組織は、心臓の遺伝子転写物（赤点線）を欠いている。 （C）トロポミオシンの免疫測定（緑）は無傷の心筋細胞ではなく、損傷した組織を（破線で囲まれた）ラベル。 DAPI（青）汚れすべての細胞の核。 （D）は核内遺伝子標識した心筋細胞急行DsRed2の（赤）。 DAPI（青）は、すべての核をラベル付けします。梗塞ゾーンは、DsRed2の陽性細胞（白点線）が含まれていません。

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</ol>

動物に関する実験的研究は、フリブール州の獣医事務所によって承認されている。

Cryoinjuryは、極端な寒さ14の正確なアプリケーションによって、組織の制御された損傷と定義されています。直接熱衝撃は、タンパク質の破壊により、プラズマ膜を破裂細胞内液の氷結晶形成により細胞を破壊する。その結果、負傷した細胞はアポトーシスとネクローシス14の過程で死亡しています。これらの細胞死のメカニズムの両方が心筋梗塞15日以降の組織の損失に貢献することが示されている。したがって、cryoinjuryは心臓梗塞を誘発するのに適したモデルを表します。いくつかの研究は、マウス、ラット、ウサギおよびブタ6,7を含む様々な哺乳類でこの井戸を証明する方法を報告した。ゼブラフィッシュにおけるcryoinjuryプロトコルの適応は、異なる種間の​​梗塞応答について比較検討することができます。 他の2つのグループが独立して大人のゼブラフィッシュの心臓のためにcryoinjury手順を開発しました。大きな違いはシュールです。gery方法、ツールの種類と適用された凍結時間。ゴンサレス·ローザらによる研究では、心膜は、組織を引き裂くの代わりに切断してオープンしました。彼らは、解凍は10観察することができるようになるまで数秒間心臓を凍結し、液体窒素で予冷ポリアミドチューブにリンクされた0.3ミリメートルの銅フィラメントを使用していました。シュナーベルらによる研究では、その直径2 mmの尖った先端を持つ20mmの長さのドライアイスの円錐形のピースが10秒8の心に触れるために使用された。二つのグループは、心筋の死を通して心室の損傷を取得しました。私たちの方法の利点は、優れた哺乳動物系で観察された初期の梗塞治癒応答を模倣したコラーゲンが豊富な傷跡、より再現性の堆積です。 ゼブラフィッシュにおけるcryoinjury手順の間に重要なステップは、基礎となる心臓を穿刺することなく、皮膚と心嚢を通して切開を行っています。正しくperformeD手術は少し出血を引き起こします。多量出血はハサミで心室の意図しない穿刺を示しています。このような場合には、動物実験から退避する必要があります。心臓を穿刺を回避するためには、はさみのポイントは、皮膚に浅い角度を目指すべきである。 再現性の傷害を作成するためのもう一つの重要な側面は、最適な正確な期間の心室に冷たいクライオの正確な位置です。短すぎると凍結時間はほとんど細胞死と炎症になります。長期凍結は、他の一方で、動物の強化された死亡につながる可能性があります心臓の広範な損傷を引き起こす可能性があります。私たちは2センチの大人のゼブラフィッシュのために23から26秒の間凍結状態の範囲内で心室を保持するために最適な時期と判断し、それが動物のサイズに依存して異なる場合があります。 私たちのプロトコルは非常に簡単かつ迅速であるため、実験的な制限はありません適切な生物学的な複製を得るために動物の十分な数を施すことでゴム手袋。凍結手術治療は非常によく動物によって許容されています。 cryoinjury後の異なる時点での心のコレクションは、再生処理中に後続のフェーズの詳細な特性評価を可能にします。 cryoinjured心の実験的解析では、in situハイブリダイゼーションによる遺伝子転写の可視化、2）免疫蛍光染色は、3によるタンパク質分布の検出）は、異なる構造の組織学的イメージング1）を含めることができます。ゼブラフィッシュにおける心筋梗塞後の重要な治癒過程を理解することは、再生生物学の分野に影響を与えます。また、再生医療に新たな治療アプローチを設計するための有益かもしれません。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ミクロ解剖春のはさみ</td><td> Roboz手術器具株式会社</td><td> RS-5602 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> E10521 </td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド〜36％ </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 47630 </td></tr><tr><td>スクロース</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 84100 </td></tr><tr><td>組織 - Tek社のOCT化合物</td><td>サクラファインテック</td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Superfrost Plusをスライド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td>ピール·ウェイ使い捨て埋め込み金型 - 金型切り捨てT8 </td><td> Polyscience株式会社</td><td> 18985 </td></tr></tbody></table>

cryoinjuryを使用した大人のゼブラフィッシュにおける心筋梗塞の誘発

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

哺乳類の心臓は、心筋梗塞1などの急性損傷後の重要な再生が不可能です。対照的に、有尾類、両生類と硬骨魚の魚はほとんど、あるいはまったく生活2,3にわたって瘢痕化した心臓の再生のための驚くべき能力を保持します。唯一のいくつかの非哺乳類の脊椎動物は4,5残留組織からの完全な臓器を再作成することができますなぜそれが知られていません。異なる種の再生応答の間に分子や細胞の違いを理解するために、我々は急性の傷害を誘導するための同様のアプローチを使用する必要があります。 哺乳類では、心臓の修復を研究するために最も頻繁に使用されるモデルは、cryoinjury 6,7後の冠状動脈や組織破壊の結紮後、急性虚血されています。イモリとゼブラフィッシュの心臓再生は、主に心室尖部2,3の一部を切除した後に検討されている。最近、いくつかのグループがestablている大人のゼブラフィッシュの8-10のcryoinjuryテクニックをished。それは、哺乳動物及び非哺乳動物種から得られた結果の比較検討することができますので、このメソッドは、大きな可能性を秘めている。 ここでは、cryoinjuryによるゼブラフィッシュの脳室の再現性の円盤状の梗塞を誘導する手法を提案する。この損傷モデルは、心室壁の心筋細胞の約20％の大規模な細胞死をもたらす急速凍結融解組織に基づいています。まず、小切開は、心臓にアクセスするには虹彩切除術をハサミで胸を介して行われました。心室壁は、直接23から25秒間液体窒素で冷却しステンレス製のクライオプローブを適用することにより、凍結した。心臓の凍結を停止するには、室温での魚の水は、クライオプローブの先端に削除されました。手順については、よく95％の生存率は、動物によって許容されています。 再生過程を特徴づけるために、心があったcryoinjury後、別の日に収集し、修正しました。その後、試料は凍結セクショニングのために埋め込まれていた。セクションを含むスライドがin situハイブリダイゼーションと免疫には 、組織学的分析のために処理した。この事業は、ゼブラフィッシュでの再生可塑性に必要であり、心臓再生の機械に新たな洞察を提供している要因の我々の理解を向上させます。ゼブラフィッシュの心臓再生の概念と分子的理解は、発生生物学と再生医学の両方に影響を与えます。

ゼブラフィッシュは、脊椎動物の心臓再生のメカニズムを研究する貴重なモデルを表しています。ここでは、cryoinjuryを用いた成体ゼブラフィッシュの心臓梗塞の誘導のためのプロトコルを提示します。哺乳類の脳梗塞で観察されたものと同様の心室壁の20％以内の大規模な細胞死では、このメソッドの結果、。

Cryoinjuryを使用した大人のゼブラフィッシュにおける心筋梗塞の誘発

哺乳類の心臓は、心筋梗塞のような急性損傷後の著しい再生を行う能力を持たない1。対照的に、有尾類の両生類および…

人間とは対照的に、ゼブラフィッシュは損傷後に心臓を再生させることができます。以下の実験の全体的な目的は、心筋梗塞に対するゼブラフィッシュの心臓再生を特性解析することです。これは、クライオインジュリー（凍結損傷）と呼ばれる手法を用いて心梗塞を誘導することで達成され、この手法により、特定の回復期間を経て心室の約20%が破壊されます。心臓を採取して固定し、異なる時点における心臓再生の進行状況を評価します。その後、固定した心臓を複製して切片化し、同一検体に対して異なる解析を行います。組織学的解析、染色、in situ ハイブリダイゼーション、および免疫蛍光法を用いることで、再生プロセスのさまざまな細胞的および分子的な側面を示す結果が得られます。心室心尖部の部分切除など、ゼブラフィッシュを用いた既存の手法に対する再損傷法の主な利点は、心筋の広範囲にわたって大規模な細胞死を誘導できる点にあります。実際、組織の急速凍結保存は、ヒトで観察される虚血誘発性梗塞の生理的反応を模倣します。この手法は、ゼブラフィッシュにおいてどのような因子が心筋細胞の増殖を刺激するのかといった、再生生物学分野における重要な問いへの答えを得るのに役立ちます。一過性の瘢痕形成と失われた心筋の再生を伴う大規模な組織リモデリングの間、損傷した心臓はどのようにして生命維持に不可欠な収縮能を維持できるのでしょうか。ゼブラフィッシュにおいて、線維化と新しい心筋形成という相反する細胞応答は、どのように調整されて完全な心臓再生が達成されるのでしょうか。この手法の意義は、哺乳類がゼブラフィッシュに比べてなぜ再生能力が低いのかをより深く理解することに繋がります。この低温損傷法については、当研究室で本手法を確立した博士課程の学生であるFabian Shaleが発表します。次に、凍結手術の準備として、テクニカルアシスタントのZimmermanが切断の手技を実演します。実体顕微鏡、鋭いピンセット、マイクロ解剖用スプリング鋏、およびプラスチック製転送ピペットを用意してください。さらに、魚の麻酔に使用するビーカーと、移動用のプラスチック製スプーンを準備してください。手術に使用する主な器具はクライオプローブです。これはステンレス製でペンのような形状をしており、手技中の凍傷を防ぐためのものです。魚を安定した位置に保持するため、プラスチックチューブとテープを使用してプローブを操作します。手順の途中で、湿らせたスポンジに溝を切ります。タイマーを2重に設定し、まず10秒のカウントダウンを行い、その後自動的に24秒のカウントダウンが行われるようにします。凍結損傷処置を開始します。まず、クライオプローブの先端を3〜5 cmの液体窒素に少なくとも3分間浸し、冷却します。成体ゼブラフィッシュを0.02%tricaineに浸し、魚が仰向けになり鰓の動きが止まるまで麻酔をかけます。ほぼ静止させます。プラスチックスプーンを用いて、魚の腹側を上にして湿らせたスポンジの溝に移動させます。利き手ではない方の手で、ピンセットを用いて魚を固定します。次に、心臓の後内側縁を目視で確認し、直剪（虹彩切除用直剪）を用いて皮膚を穿刺します。その後、皮膚と筋肉を前方に向かって直線的に切開し、心臓の上部に小さな切開口を作ります。剪刀の先端で皮下の銀色の上皮層を慎重に裂き、拍動している心室に直接アクセスできるようにします。心臓を穿刺する恐れがあるため、ハサミを体腔の深くまで挿入しないでください。胸腔切開中、拍動する心臓が十分に視認でき、広範囲な出血が起こっていないことを確認してください。プログラムされたタイマーを開始します。最初の10秒間に、クライオプローブを液体窒素から取り出し、軽く振って付着した窒素を除去します。次に、鉗子を用いて切開部を側方に広げ、胸腔を開きます。10秒のタイマーが鳴ったら、直ちに、かつ慎重に、あらかじめ冷却したクライオプローブの先端で心室に触れます。心室と密着するように、プローブを心臓上の正確な位置に配置してください。これを達成するためには、心室を切開部のちょうど中心に配置する必要があります。24秒後にタイマーが鳴ったら、プラスチックピペットを用いてシステム水を2～3 mL胸部に注ぎ、組織からクライオプローブを切り離して、魚をシステム水の入ったタンクに移してください。もし呼吸していない場合は、約45秒後にプラスチックピペットで鰓に水を噴射して刺激し、自発的に呼吸を始めるまで繰り返します。その後、心臓を回収し固定します。まず、マイクロ遠心チューブに2% formalinを1 mL準備します。また、予定日に合わせて、ピンセット2本、マイクロピンセット、解剖用はさみ、および湿らせたスリット入りスポンジを用意しておきます。凍結損傷後、魚を0.1% tricaineに5分間浸して安楽死させます。マイクロ解剖用はさみを使い、魚を腹側が上になるようにスポンジの上に置きます。鰓軟骨を通して心臓の上部に大きな切開を加えます。ピンセットを使用して、切開部位を大きく広げます。次に、心室の前方にある白い構造物である心球をピンチオフし、心臓を引っ張って体腔から取り出し、固定に回します。最大3個までの心臓を2% Forminの入ったチューブに入れます。チューブをゆっくりと数回回転させ、4 °Cで一晩保持します。心臓を封入するための準備として、PBSで5分間洗浄します。次に、あらかじめ冷却しておいた30% sucrose 10 mLに移します。心臓を1時間20分間インキュベートします。4 °Cで、心臓がチューブの底に沈みます。次に、ドライアイスを入れたボックスを用意します。その後、包埋モールドの底にOCTコンパウンドを5 mmの層になるように注ぎます。実体顕微鏡下で、ピンセットを用いて心臓をモールド内のOCT媒質に配置します。心室尖がモールドの底面に、球状動脈管が上を向くように心臓の向きを調整します。その後、OCTが凍結するまで、モールドをドライアイスの上に数分間置きます。次に、型が満たされるまでOCTを追加します。切削厚さを16 µm、チャンバー温度を-24 °C、試料温度を-22 °Cに設定してクライオスタットを準備します。試料を含む凍結ブロックをクライオスタットに設置し、ブロックの底部と平行に切削が開始されるように向きを固定します。ブロックごとに6枚のSuperfrost Plusスライドを用意し、1から6まで番号を付けます。組織に達するまでトリミングを開始し、その後カミソリ刃を用いて標本周囲のブロックを整えます。1つの心臓から6つの反復サンプルを得るために、1枚目の切片をスライド1に、2枚目をスライド2に、3枚目をスライド3に、というように順次採取します。6枚目の切片をスライド6に配置したら、再びスライド1に戻り、臓器全体を切除し終えるまでこれを繰り返します。1枚のスライドにつき、8切片を2列に採取します。スライドを室温で1時間乾燥させます。密閉容器に入れ、-20 °Cで最長1年間保存してください。ここに示すのは、凍結損傷から4日後の心臓全切片における代表的な心損傷像です。心筋組織をin vivoで可視化するため、心臓特異的なCM C twoプロモーターの制御下でEGFPおよび核局在型DsRed2を発現するトランスジェニック魚を使用した。EGFPおよびDsRed2の蛍光信号が消失している領域により、心尖部側室壁に沿った円盤状の梗塞領域が特定され、心臓の再生範囲と瘢痕化の程度が判定された。また、心筋組織と線維化組織を分染するAcid Fuchsin Orange G（AFOG）染色を用いて、組織学的解析を行った。健康な筋肉細胞はオレンジ色でラベルされています。青色のコラーゲンと赤色のフィブリンを含む瘢痕組織の遺伝子発現解析は、心室ミオシンに対するin situハイブリダイゼーションを用いて行われました。無傷の心筋由来の重鎖mRNAが青色で示されています。損傷した組織には心筋遺伝子の転写物は認められません。この図では、緑色で示されたトロポミオシンの免疫蛍光染色により、損傷していない心筋細胞が標識され、損傷組織は標識されていません。核はDAPIで染色されており、このパネルでは青色で示されています。遺伝的に標識された心筋細胞の核ではDsRed2が発現しており、DAPIはすべての核を標識しています。しかし、梗塞領域にはDsRedは含まれていません。2つの陽性細胞。適切に実施すれば、マスターリード後、1匹の魚への凍結損傷は5分以内に完了できます。この手順を行う際は、凍結損傷技術の確立後、最適な時間だけ冷凍プローブを正確にvleに配置することが重要であるという点を忘れないでください。この手法は、再生生物学分野の研究者が自然な心機能回復の根底にあるメカニズムを探索するための道を切り拓きました。この動画を視聴することで、凍結損傷を用いてCPR魚に心筋梗塞を誘発する方法について十分な理解を得ることができます。

induction-of-myocardial-infarction-in-adult-zebrafish-using-cryoinjury

Research

JoVE Journal

Medicine

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