DNA断片の分離のためのアガロースゲル電気泳動

この手順の全体的な目標は、さまざまなサイズのDNA断片を分離することです。これは、まず適切な濃度のアロスと蛍光色素を含むゲルを調製することによって達成されます。2番目のステップは、ゲルを適切な型に流し込み、次に固めることです。

サンプルをゲルにロードし、電流を流します。最後のステップは、分離されたDNA断片を紫外線の下で視覚化することです。要約すると、AGROSゲル電気泳動は、DNA断片の日常的な分離が必要なすべての状況で使用されます。

この技術の主な利点は、ショ糖密度勾配センタリフィケーションのような当時の既存の方法よりも、DNAバンドの可視化を提供することであり、また、A DNAマーカーと同時に分離されたときのDNA断片の正確なサイズの正確な符号を決定することができます。この手法は、遺伝子のクローニングやDNA分子の精製・シーケンシングなど、生命科学研究において必要不可欠な手法です。この方法は、一般的に100塩基対から25キロ塩基までのDNA断片を分離するために使用されますが、最大10メガベースのDNA断片を分離するように改変することもできます。

Agrosゲルは、重量オーバーボリュームパーセント溶液を使用して調製されます。アロスとゲルの濃度は、分離するDNA断片のサイズによって異なります。ゲルを作る手順を開始するには、適切な量のアロスを三角フラスコに秤量し、フラスコに適切な量のランニングバッファーを追加します。

緩衝液の容積は、フラスコ渦巻きの能力の3分の1を超えてはならず、マイクロ波で最大電力で加熱することにより、アロス緩衝液混合物を混合し、溶融します。32回間隔でフラスコを取り出し、中身を渦巻いて混ぜます。アグロスが完全に溶解するまでよく繰り返します。

次に、臭化アテリウムを0.5マイクログラム/ミリリットルの濃度まで加えます。臭化アテリウムは発がん性物質であるため、臭化アテリウムを含むゲルを取り扱うときは常に手袋を着用し、摂氏65度の水浴でインキュベートしてアグロスを冷やす必要があります。そうしないと、arosが冷却されている間にゲルトレイが反ります。

ゲルトレイをキャスティング装置に入れてゲル型を作製します。あるいは、ゲルトレイの開放端をテープで固定して型を作成することもできます。ゲル型に適切なコームをセットしてウェルを作成します。

型とarosをゲル型に注ぎます。arosを室温で固めます。アロスをセットしたら、コームを取り外します。

ジェルをすぐに使用しない場合は、ラップで包み、使用するまで摂氏4度で保管してください。ゲルをすぐに使用する場合は、ゲルをジェルボックスに入れます。この手順を開始するには、分離するDNAサンプルにゲルローディング色素を添加します。

ローディング染料は、通常、6 x濃度プログラムで行われ、所望の電圧への電源供給は、ゲルの表面を覆うのに十分なランニングバッファーをゲルボックスに加える。ゲルの調製に使用したものと同じランニングバッファーを使用し、ゲルボックスのリード線を電源に取り付けて電源をオンにすることが重要です。ゲルボックスと電源の両方が機能していることを確認します。

電極に気泡が現れるのは、電流が流れていることを示しています。自然と手が震えがちなので、小さなパイプの先端を小さな井戸に入れるのが難しいかもしれません。手が震えるのを防ぐ方法の1つは、もう一方の腕またはジェルボックスに手を置くことです。

ゲルボックスの蓋をゆっくりと慎重に取り外します DNAサンプルをゲルに入れます。サンプル中のローディング色素により、サンプルはゲルに沈み込み、サンプルがどれだけ移動したかを追跡するのに役立ちます。DNAサイズマーカーは、常に実験サンプルと一緒にロードする必要があります。

蓋を元に戻します。電極が電源の正しいスロットに差し込まれていることを再確認してください。電源を入れ、色素が適切な距離に移動するまでゲルを泳動させます。

電気泳動が完了したら、電源を切り、ゲルボックスの蓋を外します。ゲルボックスからゲルを取り出し、ゲル表面の余分なバッファーを排出します。ジェルトレイをペーパータオルの上に置き、残っているランニングバッファーを吸収します。

DNA断片を視覚化するには、ゲルトレイからゲルを取り出し、ゲルを紫外線にさらします。これは、ゲルドキュメンテーションシステムを使用して行うのが一般的です。DNAバンドはオレンジ色の蛍光バンドとして表示されるはずです。

実験の最後にゲルの写真を撮り、施設の規則に従ってゲルとランニングバッファーを適切に廃棄してください。この図は、PCR産物のarosゲル電気泳動後の典型的な結果を表しています。分離後、得られるDNA断片は明確に定義されたバンドです。

DNA標準またはラダーは、サンプルバンドのサイズを有用な決定が可能な程度まで分離する必要があります。この例では、765塩基対、880塩基対、および1022塩基対のDNA断片を、2 log DNAラダーを備えた1.5%AROSゲル上で分離します。手順を試行する際は、電流を印加する前に電極の配置を再確認することを覚えておくことが重要です。

これは、DNA分子が正しい方向に移動するようにするためです。このビデオを見れば、アグロ細胞の調製方法、DNA、ベアリングサイズの断片の分離方法、結果の代表的な画像の取得方法について十分に理解できるはずです。3つのブロマイドでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に手袋、ゴーグル、白衣の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。