新しいハーブ治療法を評価するために敗血症の動物モデルの使用

敗血症は、細菌感染に起因する全身性炎症反応症候群を指し、盲腸結紮穿刺（CLP）と呼ばれる手術法によってシミュレートすることができます。ここでは、治療薬のために薬草をスクリーニングするためのCLP-誘導動物モデルを使用する方法を説明します。

この手順の全体的な目標は、SQL Ligation and Puncture (CLP) と呼ばれる外科的処置によって敗血症のマウスモデルを作成することです。これは、最初にマウスの腹部に1.5〜2センチメートルの正中線を切開することによって達成されます。次に、secumを露出させて結紮し、次にseumを穿刺して細菌の転座を誘導します。

最後に、切開部を閉じます。最終的には、全身性サイトカインレベルと腹膜サイトカインレベルの増加、および無気力や致死性などの症状を示す結果を得ることができます。私がお見せするのは、Chandry博士と彼の共同研究者によって開発された元のモデルから修正された、sation and punctureと呼ばれるマウス敗血症モデルを作成することです。

このモデルの平均の主な利点は、敗血症の最も関連性の高いモデルであることです。さらに、シンプルで、特性が十分に評価され、経済的に実現可能であるため、敗血症や炎症の研究分野で広く使用されています。例として、このモデルを利用して、敗血症におけるハーブ抽出物の治療可能性を評価する方法を示します。

ハーブ抽出物を調製するには、不溶性粒子を除去するために摂氏85度で200ミリリットルの水に1〜4時間ハーブの10グラムを浸し、摂氏4度で20分間、3,300Gで水画分を遠心分離します。次に、0.2ミクロンのフィルターで上清をろ過します。次に、分子量 10 、 000 キロダルトンの遠心フィルターを使用し、摂氏 4 度で 5 、 000 G で 60 分間回転させて、濾液をさらに濃縮します。

マクロファージ培養物を使用して、高移動度グループボックス1やHGBなどの後期炎症誘発性メディエターの活性を阻害するために、低分子量画と高分子量画分をスクリーニングしました。マクロファージの単離を最初に開始するために、初代腹膜マクロファージ培養物を採取した3日後に、正常なマウスに2ミリリットルの4%THグリコールブロスを腹腔間投与し、DMEM中のマクロファージに10%FBS、2ミリモルのグルタミン、および1%ペニシリンを補給した。ストレプトマイシンは、付着性マクロファージを最適に穏やかに洗浄し、それらを同じ培地で2時間インキュベートします。

その後、刺激の16時間後に細菌のエンドトキシンリポ多糖類またはLPSでそれらを刺激します。細胞馴化培地を回収し、それを使用してウェスタンブロッティングを行います。HM GBのレベルを測定するため。

精製されたH mgb Oneで生成された標準曲線を使用してバンド強度を定量化し、ケタミン1キログラムあたり75ミリグラム、キシラジン1キログラムあたり20ミリグラムの筋肉内注射でマウスに麻酔をかけた後、敗血症を確立します。そして、つま先をつまんで鎮静のレベルを確認します。マウスを仰臥位に置き、腹部を清掃してから、15ミリメートルの正中線切開を行い、4OHシルク縫合糸で続編の先端から約5ミリメートルの盲腸を露出させます。

盲腸を結紮し、次に22ゲージの針を使用して結紮された後遺の切り株を一度穿刺して便の押し出しを可能にし、すぐに盲腸を通常の腹腔内位置に戻して腹部を閉じます。動物が意識と可動性を取り戻した後。24時間後にケージを動物室に戻します。

CLP後、腹腔内投与で200マイクロリットルのハーブ抽出物を投与するか、3日間毎日コントロールします。.シークラインゲーションと穿刺、またはCLP手術から数時間以内に、必要な限り動物の生存を監視します。動物は、立毛、嗜眠、身を寄せ合う、食物や水の摂取量の減少など、敗血症の臨床徴候を示します。

全身感染が続く重度の腹膜炎を発症した動物は、通常48〜96時間以内に死亡します。しかし、年齢、性別、遺伝的背景が一致した動物であっても、実験的敗血症の経過において、例えばCLP後48時間で、区別可能な方法で手術に反応することができる。一部の動物はここで定義されているようにマウンド状態に近づいた可能性がありますが、他の動物は瀕死の状態にとどまっている可能性があります。

循環サイトカインの包括的な調査により、瀕死状態と非瀕死状態のマウス間で、IL 6、kc、MIP 2、ST nfr 1を含むいくつかのサイトカインのレベルに劇的な違いがあることが明らかになりました。特に、これらの炎症性メディエーターは、その循環レベルが実験的または臨床的敗血症における致死結果の信頼できる予測因子であるため、敗血症の代理マーカーとして分類されています。さらに、CLPは、CLPの48時間後に、さまざまな炎症誘発性および抗炎症性サイトカインおよびケモカインの局所放出を誘導し、サイトカインIL 6およびケモカインKCおよびMI P 2のかなりの量を、血液中だけでなく腹膜洗浄液中に局所的にも測定できます。

ここでは、さまざまなハーブ抽出物または対照化合物の能力を評価し、エンドトキシン誘発性HGBの1回の放出を阻害する能力を評価しました。HGBの1回の放出を阻害する能力を持つものは、敗血症のマウスモデルを使用してin vivoでさらに試験されました。実験的な敗血症におけるHGB One蓄積の遅発性および長期の動態のため、HGB One阻害剤の初回投与は、敗血症の発症後24時間後に投与され、マウスが嗜眠、下痢、立毛などの敗血症の明確な徴候を発症した時点であり、ここに示すように、主要な緑色T成分epi Galloの遅延および反復投与、 敗血症の発症後24時間で開始するカテキン3ガレートまたはEGCGは、経口投与された場合でも致命的な敗血症からマウスを救ったEGCGは、致命的な敗血症からマウスを救い、動物の生存率を16%から44%に大幅に増加させますこの結紮を習得すると、穿刺モデルは適切に行われれば5分以内に終了することができます。