人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

次の実験の全体的な目標は、均一で三次元の神経内分泌腫瘍ステロイドを生成する簡単でシンプルな方法と、これらのステロイドの組織学を研究するためのHistoGel埋め込みを処理する簡単な方法を開発することです。これは、24ウェルプレートをエアロで均一にコーティングし、その上にヒト神経内分泌腫瘍細胞を単一細胞懸濁液中に播種することによって達成されます。次に、プレートをインキュベーター内のオービタルシェーカーで一晩40 RPM未満の速度でインキュベートし、その後、インキュベーター内の安定したシェルフに移します。

スフェロイドは3日目または4日目までに形成され、その成長と完全性は、組織学を研究するために位相差顕微鏡によって監視されます。3Dステロイドは、位相差顕微鏡法中に撮影された画像に基づいて神経内分泌腫瘍3Dステロイドの成長を示すルーチンパラフィン処理結果が得られる前に、温めたHistoGelに埋め込まれます。3Dステロイドの組織学は、hおよびeおよび3Dステロイドのパラフィンブロックセクションの免疫組織化学染色によって分析されます。

この手法が既存の方法よりも優れている主な点は、シンプルで、簡単で、信頼性が高く、費用対効果が高いことです。この手法は、神経内分泌腫瘍患者の治療薬を迅速に特定することで、創薬分野の研究を促進することができます。一般に、この方法に新しい個人は、少なくともサイズ3Dステロイドで均一に形づくられる成長するために最初に苦労する。

これの鍵は、24ウェルプレートがアグロスで均一にコーティングされていることを確認し、シングルセル懸濁液が十分に分散し、正確であることを確認することです。3Dステロイドの組織学を理解するためには、パレンプロセシングと免疫化学染色を行う必要があります。3DステロイドのHistoの埋め込みは、今日遅くに示される重要なステップです:コーティングのための1%augursを準備するには、24ウェルプレートは、250〜500ミリリットルのボトルとオートクレーブで100ミリリットルの脱イオン水に1グラムのエアロスを追加し、滅菌後にエアロスを滅菌します。

ボトルを摂氏70度のウォーターバスに約1時間移します。エアロを摂氏70度まで冷却するには、エアロを常に無菌状態に保つ必要があります。バイオセーフティキャビネットで、リピーターピペットを使用して、200マイクロリットルのエアロスを2 24の各ウェルに分注します。

このプロトコルのためのよく平らな底板。24ウェルの平底プレートは、プレートを位相差顕微鏡で画像化し、ウェルの周りのエアロを旋回させてウェルを均一に覆うことができる限り、機能します。200マイクロリットルのエアロスは、スフェロイドが一貫した球形を形成できるようにするための凹面を形成するのに最適です。

約10分後、エアロスコーティングされた24ウェルプレートを使用する準備が整います。この実験で使用した1つの細胞は、5%二酸化炭素を含む摂氏37度の加湿インキュベーター内の無菌組織培養皿に、D-M-E-M-F 12で10%FBS培地で維持された細胞であるヒト膵臓神経内分泌腫瘍またはNET細胞です。単層結合1つの細胞が70〜80%Coの流暢さに達すると、単一細胞懸濁液がバイオセーフティキャビネットに調製されます。

培地を取り出し、PBSで細胞を2回洗浄し、1ミリリットルのトリップルを加え、摂氏37度で5分間インキュベートすることにより、細胞を皿から取り除きます。顕微鏡ですべての細胞が皿から分離していることを確認してから、9ミリリットルを追加します。トリプシンへの成長培地。

アイセル 細胞を数回上下にピペットで動かし、単一細胞懸濁液を均一にします。70ミクロンのセルストレーナーを使用して細胞をろ過します。細胞数を行った後、ろ過された細胞を収集し、10%FBSの成長を伴うD-M-E-M-F 12でミリリットルあたり5, 000細胞の懸濁液を調製します。中程度。

プレート化するセルの数は、6日目の球体のサイズに基づいて経験的に決定する必要があります。理想的には、スピリットサイズが300〜400ナノマイクロメートルと直径であることが望ましいです。このため、ウェルあたり200マイクロリットルあたり1,000個の細胞をプレートします。

この手順を開始するには、200マイクロリットルの単一細胞懸濁液を、事前に調製した24ウェルプレートの各エアロコーティングウェルに重ねて、蒸発を防ぐために滅菌天井テープで24ウェルプレートをシールします。空気中に5%二酸化炭素を入れた摂氏37度の加湿インキュベーターで、ボンワン細胞を含むエアロコーティングされた24ウェルプレートをオービタルシェーカーに置き、非常にゆっくりと攪拌し、翌朝一晩インキュベートし、プレートを安定したプラットフォームに移し、インキュベーター内で培養物を成長させます。3日おき。

プレートの各ウェルに200マイクロリットルの成長培地を追加します。pheの邪魔にならないように、ピペットの先端をウェルの側面に触れ、顕微鏡下で培地を壁に流してウェルモニターOID形成を24ウェルプレートに流します。3D ステロイドの薬物治療は、培養の 6 日目に開始されます。

スフェロイドの直径が約300〜400ミクロンの場合、これは6日目の薬物治療の0日目として示されます。版の各井戸は薬剤の処置が各治療線量の各井戸で1xの最終集中にあること保障するために媒体の約400マイクロリットルを含んでおり、所望の濃度の3倍を作り、15ミリリットルの円錐管の中の成長媒体の5ミリリットルで薬剤のストックの適切な量を薄める、 これは、24ウェルプレートの各列のPHEを8回複製するのに十分であり、ビヒクル用量1、2、3、4、および5として特徴付けられます。各 24 ウェルプレートには、治療の各用量に対して 4 回の反復があります。

通常、3D pheは少なくとも2 24ウェルプレートで処理され、治療の各用量で少なくとも8回の繰り返しが行われます。それぞれに処置を加える前に、天井テープのすべての凝縮が3Dステロイドの浮遊特徴のために井戸に入ることを確かめるために24の井戸の版を回しなさい。各ウェル内の培地は、遠心分離後に除去されません。

spheの乱れを避けるために、各壁に沿って適切なウェルに各治療用量の200マイクロリットルを慎重に追加します。.24ウェルプレートを天井テープでしっかりと密封し、空気中の二酸化炭素5%を含む摂氏37度の加湿インキュベーターで培養物をインキュベートします。薬物治療後の選択した各時点で、位相差顕微鏡で3Dステロイド培養をモニターします。

PHEは10倍対物レンズでイメージングフィールドをすぐに超えるため、5倍対物レンズが理想的です。HistoGel の前に、各時点で各ウェルのステロイドの画像を取得します。ネットを埋め込むと、3Dステロイドは24ウェルプレートから収集され、10%ホルミンに固定されます。

水で満たされたビーカーに冷たいHistoGelのチューブを入れます。ビーカーを電子レンジで1分間、またはゲルが完全に液化するまで加熱します。手順の期間中、チューブを同じ水で満たされたビーカーに保管してください。

使い捨てのプラスチックピペットを使用します。すべてのステロイドを生検クライオ型に移します。ステロイドを1分間放置して、生検クライオ型の底に沈めます。

キムワイプで生検クライオ型内の液体を取り除いてみてください。つまようじを使用して、ステロイドを生検クライオ型の下部にある中央に非常に優しく押し込みます。次に、パスツールピペットを使用して、生検クライオ型の中心にあるステロイドを非常に穏やかに維持します。

温めたHistoGelの薄層を生検クライオ型に加えます。HistoGelを追加しすぎないでください。中央のステロイドを安定させるのにちょうど十分です。

HistoGel中のステロイドを室温で1〜2分間、またはHistoGelが固まるまで放置します。生検クライオ型の残りの部分に温めたHistoGelを充填し、室温で約10分間固化させます。このOIDをポップする直前に、HistoGelは生検クライオ型からブロックアウトします。

クライオ型を氷上に1分間放置し、無傷のステロイドHistoGelブロックを取り出します。ブロックをバイオラップで包み、ティッシュと生検カセットに入れます。ティッシュと生検カセットを70%エタノールの入った容器に保管します。

その後、パラフィン包埋のための日常的な組織処理手順が、Aerosコード化された24ウェルプレート上で成長したときに実行されます。異なる正味の細胞株は、ここで見られるように異なる形態を示します。ヒト膵臓ネット細胞株は1つとヒト肺ネット細胞株H7 27を結合し、3Dステロイドを形成した。

対照的に、qgp one。ヒトの膵臓網細胞は、ステロイドとは見なされない多孔質の塊のような大きなブドウを示します。結束を播種した後、アグロスコーティングされた24ウェルプレートの多細胞ステロイド形成上の1つの細胞は、通常、3日目または4日目までに発生し、ステロイドは6日目までに丸くなります。

栄養素と酸素の制限によるものです。ステロイドの密集した中心の細胞は10日目のまわりで死に始め、17日目によって、ステロイドは崩壊し始める。大きいサイズのために、または場合によっては壊死性のコードの放出のために、ステロイドは通常直径の1000ミクロンまで成長することができます。

この実験では、6日目の3Dステロイドがヒストン死死阻害剤トライクスタチンAまたはTSAによる治療の開始点として選択されました。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ネット細胞に対して抗増殖作用およびプロト作用を示すことが以前に報告されています。これらの画像は、治療開始時と 24、48、72、96 時間後の 3D ステロイドの形態を追跡します。

Vはビヒクルによる治療を示し、この場合はDMSOです。D 1 から D 5 は、各個人のサイズの TSA の用量を増やす治療を表します。OIDは、カスタム開発されたMATLABコンピュータープログラムによって自動的に推定されました。

各時点での TSA 治療の用量ごとに少なくとも 8 つの sphs が測定され、その結果はビヒクルに対してこのグラフにプロットされています。すべての用量のTSAは、3D OIDである程度の成長阻害を示しました。3Dステロイドの125ナノモルおよび250ナノモル成長のTSA濃度では、ネット3Dステロイドの組織学を理解するために強く抑制されました。

H染色とe染色、免疫組織化学染色を17日間培養した3Dステロイドに対して行った。KI 67は増殖細胞のマーカーであり、切断されたカスパーゼ3はアポトーシス細胞のマーカーです。結果は、3Dステロイドの外層細胞が活発に増殖しているが、コア内の細胞は主に壊死またはアポトーシスであることを示しています。

この手順に続いて、これらの3Dステロイドのこれらの細胞生存率を決定するために、細胞力価グローアッセイなどの追加のアッセイを実施することができます。開発後、この技術は96枚のウォールプレートに拡張してハイスループットスクリーニングを行うことができ、がん研究における治療薬の発見が容易になります。