Name: 人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 学ぶアガロースオーバーレイ法による神経内分泌腫瘍細胞の3Dスフェロイド培養とHistoGel包埋による組織学的解析。簡便で均一な球状体形成により、治療薬の効果評価を迅速に行うことができます。

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私達は誠意をこめて、MATLABのプログラムとニュージャージー病理組織学的機能と顕微鏡施設のがん研究所と彼女の助けを博士Wenjinチェンに感謝します。我々はまた、彼らのコメントと提案についてのレビューに感謝します。本研究では、レイモンドとビバリー·サックラー研究財団によってサポートされています。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

我々はアガロースでコーティングされた24ウェルプレートを用いたヒト神経内分泌腫瘍細胞からの3次元多細胞スフェロイドを形成するための、シンプルで信頼性が高く、再現可能な方法を実証した。この手法の成功は、セルの固定の番号から6日目で均質な大きさと均一な形状を持つ単一のスフェロイドを取得する機能があります。重要なステップは、めっき後の最初の16から24時間NETの細胞を用いたプレートのゆっくり攪拌します。また、このメソッドは、一般的なヒト乳癌細胞株MCF-7、ヒト結腸腺癌細胞株HT-29、ヒト非小細胞肺癌細胞株H1299とヒト胚腎臓細胞株HEK-293に適用することができます。彼らはすべての治療薬の画面（データは示さず）のための統一とコンパクトな3Dスフェロイドを形成することができます。いくつかの方法は、3D回転楕円体を生成することが報告されていますが、7月10日方法は、特殊なプレートや試薬を必要としないここで報告し、その結果、シンプルで費用対効果です。私たちの未発表データdemonstrat単層2次元のセルと比較した場合、アガロース上に成長させたNET 3D回転楕円体は、幾何学的および分子生体 NET異種移植腫瘍における模倣した電子。これは、他のヒト癌細胞株で作られた3D回転楕円体について報告されているものと似ています。3D細胞培養モデルの11,12制限は、それが完全に任意の薬剤または治療的処置の in vivoでの有効性のテストで置き換えることができないということですので、 3D回転楕円体は、この面でのin vivoで腫瘍内と異なっている、血管腫瘍のようなものです。それにもかかわらず、このメソッドはいくつかの側面における in vivo、in vitroでからNET治療薬のギャップと評価を埋めるのに役立ちます。 多細胞スフェロイドにおける免疫蛍光染色は、浮動小数点3D回転楕円体と共焦点顕微鏡の限界の大きなサイズとジオメトリーのために実行することは非常に困難である。ここでは、パラフィン包埋のためにHistoGelを処理する方法を示しています3D回転楕円体のシリアル切片スライドの免疫組織化学的染色を可能にして、埋め込む。また、私たちのカスタム開発されたMATLABプログラムは、正確かつ再現性、スフェロイドの大きさを推定する効率的な薬効を監視するのに役立ちますし、NET患者のための薬の開発におけるハイスループットスクリーニングに組み込まれる可能性があります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM/F12メディア</td><td>ギブコ</td><td> 10565-018 </td><td></td></tr><tr><td> TrypLE </td><td>ギブコ</td><td> 12604 </td><td></td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>ファルコン</td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 70mMのセルストレーナー</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 22363548 </td><td></td></tr><tr><td>滅菌シールテープ</td><td>ヌンク</td><td> 236366 </td><td></td></tr><tr><td>トリコスタチンA </td><td>シグマ</td><td> T8552 </td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 11-402-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

神経内分泌腫瘍では、（ネット）は年間100、000、個人ごとに2つの発生率と、まれな腫瘍であり、彼らはすべてのヒト悪性腫瘍の0.5％を占めています。1は、限局性疾患を呈する少数の患者の手術以外にも、あります全身療法のほとんど、またはまったく延命効果。したがって、優れたネットの生物学を理解し、特に切除不能または転移性神経内分泌腫瘍の患者さんのための新しい治療標的を定義するための優れた必要がある。 3D細胞培養は、 インビボで腫瘍組織の組織と微小環境でのモデリングで、その妥当性に起因する薬物のスクリーニングのための一般的な方法となっています。2,3次元多細胞スフェロイドが直接2Dから進んでよりタイムリーかつ安価な方法で貴重な情報を提供することができます動物（マウス）モデルへの細胞培養実験を行った。 NETパットのための新しい治療薬の発見を容易にするためにients、我々はヒトNET細胞株を用いたin vitroの3D多回転楕円体モデルで開発してきました。 NET細胞は非接着性アガロースでコーティングされた24ウェルプレートに播種し、播種後16から24時間のために非常にゆっくりと攪拌しながら、生理的条件下（5％CO 2、37℃）下でインキュベートされています。細胞は、第3または4日目に始まる多細胞スフェロイドを形成しています。スフェロイドは、薬物治療が開始される時点で、6日目 、することで、より球状になります。 NETスフェロイドに対する薬物治療の有効性は、位相差光学顕微鏡によるスフェロイドの形態、形状、サイズに基づいて監視されています。スフェロイドのサイズが自動的にアクティブな輪郭アルゴリズムに基づいてカスタム開発されたMATLABプログラムを用いて推定されています。さらに、我々は標準組織学的および免疫組織化学的手法を使用することができ、これらの3D回転楕円体上のHistoGel埋め込みを処理する簡単な方法を示しています。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;これは、治療薬の効果を調べるためにNET細胞株を用いた3次元回転楕円体を生成する上で最初の報告である。また、これらの3次元回転楕円体で組織を行い、NETスフェロイドの成長と増殖に対する単剤の効果の例を表示しています。我々の結果は、スフェロイドNETは、NET生物学と医薬品開発のさらなる研究のために貴重であることをサポートしています。

我々は、神経内分泌癌細胞株を用いた3次元多細胞スフェロイドを成長させるシンプルなアガロースオーバーレイプラットフォームを提示します。このメソッドは、神経内分泌腫瘍細胞に治療薬の効果を調べるために非常に便利な方法を提供します。それはまた、私たちはがん治療のための人間の神経内分泌腫瘍のスフェロイドを確立するのに役立つ可能性があります。

神経内分泌腫瘍（NETs）は、年間10万人あたり2人の発生率である稀な腫瘍であり、全人類の...の0.5%を占めています。

本実験の全体的な目的は、均一な3次元神経内分泌腫瘍スフェロイドを作製するための簡便かつ容易な手法と、これらのスフェロイドの組織学を研究するためのHistoGel包埋処理の簡便な手法を開発することである。これは、24ウェルプレートにアガロースを均一にコーティングし、その上に単一細胞懸濁液の状態にしたヒト神経内分泌腫瘍細胞を播種することで達成される。その後、プレートをインキュベーター内のオービタルシェーカーで40 RPM未満の速度で一晩インキュベートし、次いでインキュベーター内の固定棚に移動させる。スフェロイドは3日目または4日目までに形成され、その組織学的な研究を行うため、位相差顕微鏡を用いて成長と完全性がモニタリングされます。3Dスフェロイドは、通常のパラフィン処理に先立ち、加温したHistoGelに包埋されます。位相差顕微鏡で撮影された画像に基づき、神経内分泌腫瘍の3Dスフェロイドの成長を示す結果が得られます。3Dスフェロイドの組織学的な解析は、3Dスフェロイドのパラフィンブロック切片を用いて、H&amp;E染色および免疫組織化学染色によって行われます。既存の手法に対する本手法の主な利点は、簡便で容易であり、信頼性と費用対効果が高いことです。この手法は、神経内分泌腫瘍患者に対する治療薬の迅速な特定を支援することで、創薬分野の研究を促進することができます。一般的に、本手法を初めて行う方は、当初、サイズが均一な形状の3Dステロイドを育成することに苦労すると思われます。重要なポイントは、24ウェルプレートにアガロースが均一にコーティングされていること、および単一細胞懸濁液が十分に分散し、正確な量であることです。3Dステロイドの組織学を理解するためには、パラフィン包埋処理と免疫化学染色を行う必要があります。3Dステロイドの組織包埋は重要なステップであり、後ほど実演します。24ウェルプレートのコーティング用1%アガロースを調製するには、250～500 mLのボトルに1 gのアガロースと100 mLの脱イオン水を加え、オートクレーブでアガロースを滅菌します。ボトルを70 °Cの水槽に入れ、約1時間保持します。aerosを70 °Cまで冷却させる間、aerosは常に無菌状態に保つ必要があります。バイオセーフティキャビネット内で、リピーターピペットを使用して、24ウェルプレートの各ウェルに200 µLのaerosを分注します。本プロトコルでは、フラットボトムプレートを使用します。位相差顕微鏡下で観察可能なものであれば、どのような種類の24ウェルフラットボトムプレートでも使用可能です。ウェル内でアガロースを回し、ウェル全体に均一に広げてください。スフェロイドが一定の球形に形成されるよう、凹面を作るには200 µLのアガロースが最適です。約10分後、Aerosコート済みの24ウェルプレートが使用可能になります。本実験で使用するBON-1細胞は、ヒト膵神経内分泌腫瘍（NET）細胞であり、10% FBS含有DMEM/F12培地を用い、37°C、5% CO₂の加湿インキュベーター内で、滅菌済み組織培養ディッシュにて維持されています。単層のBON-1細胞が70〜80%のコンフルエンシーに達したら、バイオセーフティーキャビネット内で単一細胞懸濁液を調製します。培地を除去し、PBSで細胞を2回洗浄します。1 mLのTrypLEを加え、37 °Cで5分間インキュベートして、ディッシュから細胞を剥離させます。顕微鏡下で、すべての細胞がディッシュから剥離したことを確認し、その後、トリプシンに9 mLの増殖培地を加えます。眼細胞をピペッティングして数回上下に混ぜ、均一な単一細胞懸濁液にします。70 µmのセルストレーナーを用いて細胞をろ過します。ろ過後の細胞を回収して細胞数をカウントし、10% FBS添加D-M-E-M-F 12増殖培地を用いて、1 mLあたり5,000個の細胞懸濁液を調製します。播種する細胞数は、6日目のスフィアの大きさに基づいて経験的に決定する必要があります。理想的には、スフィアの直径を300から400 µmの間にすることが望ましいです。そのため、本手法では1ウェルあたり200 µLにつき1,000個の細胞を播種します。本手順を開始するには、あらかじめ準備したaerosコート済みの24ウェルプレートの各ウェルに、単一細胞懸濁液を200 µLずつ分注し、蒸発を防ぐために滅菌シーリングテープで24ウェルプレートを密閉します。BON-1細胞を含むaeroコート済み24ウェルプレートを、5% CO2含有空気に設定した37 °Cの加湿インキュベーター内のオービタルシェーカーに設置し、非常に緩やかな振盪で一晩インキュベートします。翌朝、プレートを安定した台に移動させ、インキュベーター内で3日ごとに培養を継続します。プレートの各ウェルに200 µLの増殖培地を加えます。オルガノイドを乱さないよう、ピペットチップをウェルの壁面に当て、培地が壁を伝ってウェル内に流れ込むようにします。24ウェルプレート内のOID形成を顕微鏡下で観察します。3Dステロイドの薬剤処理は、培養6日目に開始します。スフェロイドの直径が300～400 µmに達した時点を、6日目の薬剤処理における0日目と定義します。各ウェルに約400 µLの培地を入れることで、各投与量において各ウェル内の薬剤処理の最終濃度が1xになるようにします。希望する濃度の3倍の薬剤溶液を調製し、15 mLコニカルチューブ内で適切な量の薬剤ストックを5 mLの増殖培地で希釈します。これで8つのリプリケート分に相当します。24ウェルプレートの各行のspheroidsは、Vehicle、投与量1、2、3、4、および5として設定します。各24ウェルプレートにおいて、各投与量につき4つのリプリケートを設けます。通常、3D pheは少なくとも2枚の24ウェルプレートで処理し、各投与量につき少なくとも8つのレプリケートを確保します。各ウェルに処理剤を添加する前に、24ウェルプレートをスピンダウンさせ、3Dステロイドの浮遊特性により天井テープに付着した結露がすべてウェル内に戻るようにします。遠心分離後、各ウェルの培地は除去しません。スフィアへの乱れを防ぐため、各用量の処置液200 microlitersを、それぞれのウェルの壁面に沿って注意深く加えます。24ウェルプレートをシーリングテープで密閉し、5%carbon dioxideを含む37 degree Celsiusの加湿インキュベーター内で培養します。薬剤投与後、設定した各タイムポイントにおいて、位相差顕微鏡を用いて3Dステロイド培養の状態を観察します。PHEは10 x 対物レンズではすぐにイメージング視野からはみ出してしまうため、5 x 対物レンズが最適です。HistoGelによる包埋の前に、各タイムポイントで各ウェル内のステロイドの画像を撮影します。包埋用の3Dステロイドを24ウェルプレートから回収し、10% Formalinで固定します。冷やしたHistoGelのチューブを水を入れたビーカーに入れます。ビーカーを電子レンジで1分間、またはゲルが完全に液状になるまで加熱します。手順の間、チューブは同じ水入りビーカーに入れたままにしておきます。使い捨てプラスチックピペットを用いて、すべてのステロイドを生検用クライオモールドに移します。ステロイドを生検用クライオモールドの底に沈殿させるため、1分間静置します。キムワイプを用いて、生検用クライオモールド内の液体を取り除きます。爪楊枝を使い、ステロイドを非常にゆっくりと生検用クライオモールドの底面中央に押し込みます。次に、パスツールピペットを使用して、ステロイドが生検用クライオモールドの中央に保持されるよう非常に慎重に調整します。温めたHistoGelをバイオプシー用クライオモールドに薄く層状に加えます。HistoGelを入れすぎないようにしてください。ステロイドを中央で固定するのに十分な量だけを加えます。HistoGel中のステロイドを、室温で1〜2分間、またはHistoGelが凝固するまで静置します。生検用クライオモールドの残りの部分を温めたHistoGelで満たし、室温で約10分間凝固させます。その後、このOIDs HistoGelブロックを生検用クライオモールドから取り出します。クライオモールドを氷上に1分間置き、その後、無傷のステロイドHistoGelブロックを取り出します。ブロックをバイオラップで包み、組織・生検カセットに入れます。組織・生検カセットを70%ethanolが入った容器に保存します。その後、aerosコード付き24ウェルプレートで培養された場合、パラフィン包埋のためのルーチンの組織処理手順が行われます。ここでは、異なるNET細胞株が異なる形態を示すことがわかります。ヒト膵NET細胞株BON-1およびヒト肺NET細胞株H727は、3Dスフェロイドを形成しました。対照的に、qgp oneでは、ヒト膵島細胞はブドウのような大きな多孔質塊を示しますが、これらはスフェロイドとは見なされません。アグロースコーティングした24ウェルプレートに細胞を播種すると、通常は3日目または4日目までに多細胞スフェロイドの形成が起こり、6日目までにスフェロイドはより球状になります。栄養素および酸素の制限により、ステロイドの緻密な中心部にある細胞は10日目あたりから死滅し始め、17日目までにはステロイドが崩壊し始めます。その大きなサイズ、あるいは場合によっては壊死した索状組織の放出により、ステロイドは通常、直径1000 micronsまで成長することがあります。本実験では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンA（TSA）による処理の開始点として、6日目の3Dスフェロイドを選択しました。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、NET細胞に対して抗増殖作用およびプロアポトーシス作用を示すことが以前に報告されています。これらの画像は、処理開始時、およびその24時間、48時間、72時間、96時間後の3Dスフェロイドの形態を追跡したものです。Vはビヒクルによる処理を示しており、本ケースではDMSOとなります。D1からD5は、TSAの投与量を段階的に増やした処理を表しています。各個体のOIDは、独自に開発したMATLABコンピュータプログラムによって自動的に算出されました。各タイムポイントにおけるTSA処理の用量ごとに、少なくとも8個のsphを測定し、その結果をビークルに対する相対値としてこのグラフにプロットしました。すべての用量のTSAにおいて、3D OIDのある程度の増殖抑制が見られました。125 nano molarおよび250 nano molarのTSA濃度では、3Dステロイドの増殖が強く抑制され、ネット3Dステロイドの組織学的な理解が得られました。17日間培養した3Dステロイドを用いて、H&amp;E染色および免疫組織化学染色を行った。Ki67は増殖細胞のマーカーであり、切断型caspase-3はアポトーシス細胞のマーカーである。結果から、3Dステロイドの外層細胞は活発に増殖しているが、コア内部の細胞は大部分が壊死またはアポトーシスに陥っていることが示された。この手順の後、これらの3Dステロイドの細胞生存率を決定するために、セルタイターグローアッセイなどの追加アッセイを実施することができます。本手法の開発後、これを96ウェルプレートに拡張してハイスループットスクリーニングを行うことができ、これによりがん研究における治療薬の探索が促進されます。

human-neuroendocrine-tumor-cell-lines-as-three-dimensional-model-for

Research

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医学

我々は、確立するための方法論を記述する...

三次元異<em&gt; in vitroで</em卵巣がんの発生と進行中に間質相互作用の上皮&gt;モデリング

表現型の野生型アストロサイトと神経幹細胞は、floxed、条件付き発癌性対立遺伝子で操作され、ウイルスCre媒介組換えを介して形質転換されたマウスから採取され、同系で免疫能力のある同腹仔の脳に形質転換細胞を同所性注射することにより、in vitroおよびin...

モデル星細胞腫発症機序体外とインビボ皮質アストロサイトまたは条件付き、遺伝子改変マウスから神経幹細胞を使用した

ヒト多発性骨髄腫（MM）細胞は、間葉系細胞と生存および増殖のための細胞外マトリックス成分の支援微小環境が必要です。我々は、腫瘍の増殖、浸潤および血管形成に対する抗がん剤の効果を研究するために移植されたヒト骨髄腫および間葉細胞とin vivoでニワトリ胚モデルを確立しました。...

腫瘍の増殖、浸潤及び血管新生を研究するために、ニワトリでのヒト多発性骨髄腫異種移植モデルの確立

患者由来の多形性膠芽腫の異種移植片は、3Dヒトバイオゲル培養システムを使用して生きた微小腫瘍に小型化することができます。このin vivo様3D腫瘍アッセイは、薬物反応試験やキノミクス解析を含む分子プロファイリングに適しています。...

Kinomicプロファイリングと薬物反応検査のための3D人間バイオゲル培養システムと患者由来の神経膠芽腫細胞を用いた微小腫瘍の発生

療法の評価を目指して私たち頭頸部扁平上皮癌細胞株に対する実験的治療レジメンの現在の規格をテストすることができる回転楕円体に基づく、三次元の in...

治療の頭頸部扁平上皮癌に対する回転楕円体に基づく 3 D 細胞培養モデルのテスト

さまざまな病気の徴候でもっと生理学的に関連するモデル開発およびに実装した創薬プログラムであります。ここで説明した新しいモデルのシステムは、回転楕円体を培養し、新しい抗がん剤を検索する高スループット 1536 ウェル プレート ベース...

創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成

頭頸部扁平上皮癌同所性同種モデルマウスを開発するための再現可能な方法をご紹介します。腫瘍免疫の浸潤、リンパ節転移、貧しい分化壊死を含む病気の臨床的病理組織学的機能について示します。担癌マウスでは、嚥下障害、顎の変位、減量など臨床的に関連する症状を起こします。...

腫瘍免疫プロファイル用のマウスおよび治療応答評価における扁平上皮癌細胞の粘膜接種

本研究では、ヒトの神経オルガノイド内のヒト神経オルガノイド内のヒト神経膠芽腫の発達を研究するための関連的かつ正確なモデルとして、2つの特定のヒト神経オルガノイドを導出するプロトコルを紹介し、説明する。三次元オルガノイドを生成する分化。...

脳癌と神経変性疾患を研究するためのヒト神経オルガノイド

神経内分泌腫瘍(NETs)は神経堤の神経内分泌細胞に由来する。彼らは成長が遅く、文化に挑戦しています。我々は、スフェロイドとしてそれらを培養することにより、小腸からNETを成長させるための代替戦略を提示します。これらのスフェロイドは、小さな腸ネットマーカーを有し、薬物検査に使用することができます。...

小腸神経内分泌腫瘍スフェロイドの確立と特徴付け

この論文では、神経芽腫細胞株を以前に説明した3次元コラーゲンベースの足場に播種し、所定の時間枠で細胞増殖を維持し、さまざまな実験目的を満たすために適応可能な、いくつかの細胞増殖および細胞挙動分析およびダウンストリームアプリケーション用の足場を回収するために必要な手順をリストしています。...

コラーゲンベースの足場を用いた神経芽細胞腫の3次元 in vitro 生体模倣モデル

この記事では、3次元腫瘍スフェロイドを構築するための標準化された方法を示します。また、自動イメージングシステムを用いたスフェロイド観察と画像ベースの深層学習解析の戦略についても説明します。...

医薬品評価研究のための3D腫瘍スフェロイドの作製

学ぶアガロースオーバーレイ法による神経内分泌腫瘍細胞の3Dスフェロイド培養とHistoGel包埋による組織学的解析。簡便で均一な球状体形成により、治療薬の効果評価を迅速に行うことができます。

人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

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