人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

本実験の全体的な目的は、均一な3次元神経内分泌腫瘍スフェロイドを作製するための簡便かつ容易な手法と、これらのスフェロイドの組織学を研究するためのHistoGel包埋処理の簡便な手法を開発することである。これは、24ウェルプレートにアガロースを均一にコーティングし、その上に単一細胞懸濁液の状態にしたヒト神経内分泌腫瘍細胞を播種することで達成される。その後、プレートをインキュベーター内のオービタルシェーカーで40 RPM未満の速度で一晩インキュベートし、次いでインキュベーター内の固定棚に移動させる。

スフェロイドは3日目または4日目までに形成され、その組織学的な研究を行うため、位相差顕微鏡を用いて成長と完全性がモニタリングされます。3Dスフェロイドは、通常のパラフィン処理に先立ち、加温したHistoGelに包埋されます。位相差顕微鏡で撮影された画像に基づき、神経内分泌腫瘍の3Dスフェロイドの成長を示す結果が得られます。3Dスフェロイドの組織学的な解析は、3Dスフェロイドのパラフィンブロック切片を用いて、H&E染色および免疫組織化学染色によって行われます。

既存の手法に対する本手法の主な利点は、簡便で容易であり、信頼性と費用対効果が高いことです。この手法は、神経内分泌腫瘍患者に対する治療薬の迅速な特定を支援することで、創薬分野の研究を促進することができます。一般的に、本手法を初めて行う方は、当初、サイズが均一な形状の3Dステロイドを育成することに苦労すると思われます。

重要なポイントは、24ウェルプレートにアガロースが均一にコーティングされていること、および単一細胞懸濁液が十分に分散し、正確な量であることです。3Dステロイドの組織学を理解するためには、パラフィン包埋処理と免疫化学染色を行う必要があります。3Dステロイドの組織包埋は重要なステップであり、後ほど実演します。24ウェルプレートのコーティング用1%アガロースを調製するには、250～500 mLのボトルに1 gのアガロースと100 mLの脱イオン水を加え、オートクレーブでアガロースを滅菌します。

ボトルを70 °Cの水槽に入れ、約1時間保持します。aerosを70 °Cまで冷却させる間、aerosは常に無菌状態に保つ必要があります。バイオセーフティキャビネット内で、リピーターピペットを使用して、24ウェルプレートの各ウェルに200 µLのaerosを分注します。

本プロトコルでは、フラットボトムプレートを使用します。位相差顕微鏡下で観察可能なものであれば、どのような種類の24ウェルフラットボトムプレートでも使用可能です。ウェル内でアガロースを回し、ウェル全体に均一に広げてください。スフェロイドが一定の球形に形成されるよう、凹面を作るには200 µLのアガロースが最適です。

約10分後、Aerosコート済みの24ウェルプレートが使用可能になります。本実験で使用するBON-1細胞は、ヒト膵神経内分泌腫瘍（NET）細胞であり、10% FBS含有DMEM/F12培地を用い、37°C、5% CO₂の加湿インキュベーター内で、滅菌済み組織培養ディッシュにて維持されています。単層のBON-1細胞が70〜80%のコンフルエンシーに達したら、バイオセーフティーキャビネット内で単一細胞懸濁液を調製します。

培地を除去し、PBSで細胞を2回洗浄します。1 mLのTrypLEを加え、37 °Cで5分間インキュベートして、ディッシュから細胞を剥離させます。顕微鏡下で、すべての細胞がディッシュから剥離したことを確認し、その後、トリプシンに9 mLの増殖培地を加えます。

眼細胞をピペッティングして数回上下に混ぜ、均一な単一細胞懸濁液にします。70 µmのセルストレーナーを用いて細胞をろ過します。ろ過後の細胞を回収して細胞数をカウントし、10% FBS添加D-M-E-M-F 12増殖培地を用いて、1 mLあたり5,000個の細胞懸濁液を調製します。

播種する細胞数は、6日目のスフィアの大きさに基づいて経験的に決定する必要があります。理想的には、スフィアの直径を300から400 µmの間にすることが望ましいです。そのため、本手法では1ウェルあたり200 µLにつき1,000個の細胞を播種します。

本手順を開始するには、あらかじめ準備したaerosコート済みの24ウェルプレートの各ウェルに、単一細胞懸濁液を200 µLずつ分注し、蒸発を防ぐために滅菌シーリングテープで24ウェルプレートを密閉します。BON-1細胞を含むaeroコート済み24ウェルプレートを、5% CO2含有空気に設定した37 °Cの加湿インキュベーター内のオービタルシェーカーに設置し、非常に緩やかな振盪で一晩インキュベートします。翌朝、プレートを安定した台に移動させ、インキュベーター内で3日ごとに培養を継続します。

プレートの各ウェルに200 µLの増殖培地を加えます。オルガノイドを乱さないよう、ピペットチップをウェルの壁面に当て、培地が壁を伝ってウェル内に流れ込むようにします。24ウェルプレート内のOID形成を顕微鏡下で観察します。3Dステロイドの薬剤処理は、培養6日目に開始します。

スフェロイドの直径が300～400 µmに達した時点を、6日目の薬剤処理における0日目と定義します。各ウェルに約400 µLの培地を入れることで、各投与量において各ウェル内の薬剤処理の最終濃度が1xになるようにします。希望する濃度の3倍の薬剤溶液を調製し、15 mLコニカルチューブ内で適切な量の薬剤ストックを5 mLの増殖培地で希釈します。これで8つのリプリケート分に相当します。24ウェルプレートの各行のspheroidsは、Vehicle、投与量1、2、3、4、および5として設定します。各24ウェルプレートにおいて、各投与量につき4つのリプリケートを設けます。

通常、3D pheは少なくとも2枚の24ウェルプレートで処理し、各投与量につき少なくとも8つのレプリケートを確保します。各ウェルに処理剤を添加する前に、24ウェルプレートをスピンダウンさせ、3Dステロイドの浮遊特性により天井テープに付着した結露がすべてウェル内に戻るようにします。遠心分離後、各ウェルの培地は除去しません。

スフィアへの乱れを防ぐため、各用量の処置液200 microlitersを、それぞれのウェルの壁面に沿って注意深く加えます。24ウェルプレートをシーリングテープで密閉し、5%carbon dioxideを含む37 degree Celsiusの加湿インキュベーター内で培養します。薬剤投与後、設定した各タイムポイントにおいて、位相差顕微鏡を用いて3Dステロイド培養の状態を観察します。

PHEは10 x 対物レンズではすぐにイメージング視野からはみ出してしまうため、5 x 対物レンズが最適です。HistoGelによる包埋の前に、各タイムポイントで各ウェル内のステロイドの画像を撮影します。包埋用の3Dステロイドを24ウェルプレートから回収し、10% Formalinで固定します。

冷やしたHistoGelのチューブを水を入れたビーカーに入れます。ビーカーを電子レンジで1分間、またはゲルが完全に液状になるまで加熱します。手順の間、チューブは同じ水入りビーカーに入れたままにしておきます。

使い捨てプラスチックピペットを用いて、すべてのステロイドを生検用クライオモールドに移します。ステロイドを生検用クライオモールドの底に沈殿させるため、1分間静置します。

キムワイプを用いて、生検用クライオモールド内の液体を取り除きます。爪楊枝を使い、ステロイドを非常にゆっくりと生検用クライオモールドの底面中央に押し込みます。次に、パスツールピペットを使用して、ステロイドが生検用クライオモールドの中央に保持されるよう非常に慎重に調整します。

温めたHistoGelをバイオプシー用クライオモールドに薄く層状に加えます。HistoGelを入れすぎないようにしてください。ステロイドを中央で固定するのに十分な量だけを加えます。

HistoGel中のステロイドを、室温で1〜2分間、またはHistoGelが凝固するまで静置します。生検用クライオモールドの残りの部分を温めたHistoGelで満たし、室温で約10分間凝固させます。その後、このOIDs HistoGelブロックを生検用クライオモールドから取り出します。

クライオモールドを氷上に1分間置き、その後、無傷のステロイドHistoGelブロックを取り出します。ブロックをバイオラップで包み、組織・生検カセットに入れます。組織・生検カセットを70%ethanolが入った容器に保存します。

その後、aerosコード付き24ウェルプレートで培養された場合、パラフィン包埋のためのルーチンの組織処理手順が行われます。ここでは、異なるNET細胞株が異なる形態を示すことがわかります。ヒト膵NET細胞株BON-1およびヒト肺NET細胞株H727は、3Dスフェロイドを形成しました。

対照的に、qgp oneでは、ヒト膵島細胞はブドウのような大きな多孔質塊を示しますが、これらはスフェロイドとは見なされません。アグロースコーティングした24ウェルプレートに細胞を播種すると、通常は3日目または4日目までに多細胞スフェロイドの形成が起こり、6日目までにスフェロイドはより球状になります。

栄養素および酸素の制限により、ステロイドの緻密な中心部にある細胞は10日目あたりから死滅し始め、17日目までにはステロイドが崩壊し始めます。その大きなサイズ、あるいは場合によっては壊死した索状組織の放出により、ステロイドは通常、直径1000 micronsまで成長することがあります。

本実験では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンA（TSA）による処理の開始点として、6日目の3Dスフェロイドを選択しました。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、NET細胞に対して抗増殖作用およびプロアポトーシス作用を示すことが以前に報告されています。これらの画像は、処理開始時、およびその24時間、48時間、72時間、96時間後の3Dスフェロイドの形態を追跡したものです。

Vはビヒクルによる処理を示しており、本ケースではDMSOとなります。D1からD5は、TSAの投与量を段階的に増やした処理を表しています。各個体のOIDは、独自に開発したMATLABコンピュータプログラムによって自動的に算出されました。

各タイムポイントにおけるTSA処理の用量ごとに、少なくとも8個のsphを測定し、その結果をビークルに対する相対値としてこのグラフにプロットしました。すべての用量のTSAにおいて、3D OIDのある程度の増殖抑制が見られました。125 nano molarおよび250 nano molarのTSA濃度では、3Dステロイドの増殖が強く抑制され、ネット3Dステロイドの組織学的な理解が得られました。

17日間培養した3Dステロイドを用いて、H&E染色および免疫組織化学染色を行った。Ki67は増殖細胞のマーカーであり、切断型caspase-3はアポトーシス細胞のマーカーである。結果から、3Dステロイドの外層細胞は活発に増殖しているが、コア内部の細胞は大部分が壊死またはアポトーシスに陥っていることが示された。

この手順の後、これらの3Dステロイドの細胞生存率を決定するために、セルタイターグローアッセイなどの追加アッセイを実施することができます。本手法の開発後、これを96ウェルプレートに拡張してハイスループットスクリーニングを行うことができ、これによりがん研究における治療薬の探索が促進されます。