2012年10月15日
その場でパッチクランプ記録をそのまま回路内の神経細胞の電気生理学的特性評価のために使用されます。中枢神経系が小さく、堅牢な鞘に囲まれているため、ショウジョウバエ遺伝モデルパッチクランプ法では困難である。この記事では、後続のパッチクランプ記録用のシースときれいなニューロンを削除する手順について説明します。
この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの飛行運動ニューロン5をC 2パッチクランプ記録用に準備することです。これは、まず、GFPタグ付き飛行運動ニューロン1〜5を使用して、40 x水浸漬レンズを介してショウジョウバエ腹側神経索を視覚化することによって達成されます。2番目のステップは、壊れたプロテアーゼ充填パッチピペットを使用して、GFPタグ付き運動ニューロン全体にプロテアーゼを塗布し、運動ニューロン5へのアクセスを妨げる破片グリアと気管を緩めることです。
次に、緩んだ破片とグリアをピペットに優しく吸い込み、正圧と負圧を加えて気管を邪魔にならないように引き抜くことにより、グリアと気管を取り除きます。あるいは、この時点では、蛍光灯ではGFPフィルターを通して見ることができない残りの破片を明るい光で除去します。最終的に、洗浄された運動ニューロン5は、明るい光の下ではかすかに見えますが、GFPフィルター付きの蛍光灯を使用するとよく見えます。
生理食塩水で細胞を15〜20分間すすいだ後、その後の2つのパッチクランプ記録をその場で行うための準備をします。今日お見せする手順は、どのイオンチャネルが根底にあるのか、どのイオン電流が下にあるのか、そしてどのイオン電流が行動の根底にあるのかなど、神経生理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。一般に、この技術に不慣れな人は、ペットクランプ実験の前に必要な洗浄手順中にニューロンの外観の微妙な変化を見るのが難しいため、苦労します。
細胞膜がきれいであることは、その後のペットランプのその場記録の重要な前提条件であり、細胞膜の清浄度を判断するのは非常に難しいため、手順の視覚的なデモンストレーションをお見せします。今日それをどのように行うのですか?この手順は、ペトリ皿を直立した固定ステージのエピ蛍光顕微鏡に取り付けることから始めます。
次に、ハエが入った皿を、電極ホルダーが取り付けられている側に前部が向くように配置します。次に、高倍率、高NA水浸漬レンズ、およびAGFPフィルターで腹側神経索を観察します。ザ・ 運動ニューロン 5 中胸部神経鏡の神経節の背側表面に両側に位置し、顕著な気管運動ニューロン5とそれらの樹状突起の間の神経節の正中線の近くに、拡散した緑色の領域として表示されます。
ソマートは掃除後により鮮明になります。ただし、樹状突起は組織で覆われているため、ぼやけたままになります。ここでは、NDフィルターを使用して、蛍光灯、特に青色光の多すぎることによる組織の露出過多を防ぎます。
漂白が発生した場合は、光出力が強すぎてセルが写真で損傷している可能性があります。吸引が安定し、生理食塩水の出口が記録チャンバー内の溶液レベルが上下に変動しないように配置されていることを確認してください。安定した安定した灌流は、お風呂から生理食塩水が絶えず吸引されることによって生成される、常に中断されないゴロゴロという音に反映されます。
次に、コックまたは特定の直径のチューブを使用して、記録チャンバーの灌流速度を毎分約2ミリリットルに調整します。チャンバー内の溶液の迅速な交換を保証するために、チャンバーの容積はできるだけ小さくする必要があります。これにより、プロテアーゼとブロッカーの迅速な除去が保証されます。記録チャンバーから、皮下注射針を曲げて、生理食塩水の入口と出口として細いチューブに取り付けます。
次に、粘土で記録チャンバーの近くに置きます。次に、ピペットプーラーでパッチピペットを引っ張ります。きれいな鉗子で顕微鏡下で先端を少し折ります。
次に、ピペットを目詰まりしないように2%プロテアーゼとPBSバッファーを充填します。ピペットを電極ホルダーに挿入します。加えられた圧力を適切に制御するために、ホルダーはしっかりと密閉する必要があります。
次に、ピペットホルダーの小さな出口にチューブを取り付けます。チューブの自由端を引っ張っても挿入されたピペットに影響を与えないように固定します顕微鏡下でのピペットの動きを確認します。次に、プラスチック製のピペットチップをチューブの自由端に挿入して、ピペットに正圧または負圧を加えます。
次に、40 x 水浸レンズの下の酵素充填ピペットを明るい光で視覚化します。ピペットチップに注目してください。目詰まりしている場合は、正圧または負圧を加えて汚れを落としてみてください。
汚れが出ない場合は、新しい酵素入りピペットを用意してください。次に、蛍光灯に切り替えます。酵素の入ったピペットを慎重に下げ、細胞体が見えるまでピントを合わせ直します。
ピペットが細胞本体に近づいたら、灌流をオフにし、細胞本体に向かって短時間ずつ陽圧を加え、細胞へのアクセスを妨げているものがすべて緩むようにします。次に、背側を動かして、正圧と負圧を交互に加えながら、腹側神経索を囲む神経節鞘から残っている可能性のある緩い破片をキャッチします。
ピペットを掃除機のように使用して、細胞体の周りを掃除します。このクリーニング手順は、メンブレンに破片がなくなるまで行われます。次に、高強度の青色蛍光灯を使用して膜をすばやく観察し、膜がきれいであることを確認して、運動ニューロンが明るい光に切り替わり、蛍光灯では見えなかった細胞や破片を取り除くことを視覚化します。
クリーニング手順が終了したら、灌流システムのスイッチを再びオンにし、ライトをオフにします。次に、生理食塩水または使用する溶液で細胞を約15〜20分間すすぎます。垂直ピペットプーラーを使用して、ホウ素ケイ酸ガラスキャピラリーからパッチピペットを引き出します。
次に、電圧クランプおよび電流クランプモードで全細胞パッチクランプ記録を従来のその場に行うと、ここに示されているのは、運動ニューロン5から記録されるカルシウム電流の一例である。カルシウム電流には、低電圧で活性化される過渡的なカルシウム電流と、持続的な高電圧のカルシウム電流の少なくとも2種類があります。そして、これは運動ニューロン5から記録されたカリウム電流の一例です。
この図には全カリウム電流が示されており、この図は、全カリウム電流から持続カリウム電流を差し引いた純粋な過渡カリウム電流が得られる持続カリウム電流のみを示しています。これは、運動ニューロン5の体細胞電流注入によって誘発される発火パターンの例です。静止膜電位はマイナス59ミリボルトです 一度習得すると、動物の前の部分とその後の製剤のすすぎを除いて、手順は5分で行うことができます。
このビデオを見た後、TRALA腹側神経索で特定されたニューロンを洗浄して、パッチランプの録音内での後続の準備を行う方法について十分に理解できるはずです。
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この記事では、ショウジョウバエの飛行モーターニューロン5のin situパッチクランプ記録の準備手順を詳述しています。この方法には、ニューロンの可視化と電気生理学的特性の評価のためのアクセスを容易にするための障害となる破片の除去が含まれます。
Reliable preparation of Drosophila central neurons for in situ patch clamping enables high-resolution functional interrogation of ion channel activity in a genetically tractable model. This workflow addresses a critical bottleneck in linking genotype to neuronal excitability and behavior, supporting mechanistic de-risking and target validation in early neuroscience discovery. The method enhances predictive confidence for ion channel function studies, informing portfolio decisions in neuropharmacology and channelopathy research.
This neuron preparation method integrates into the discovery continuum from genetic manipulation through electrophysiological validation and early lead identification.