2013年4月30日
ここでは、のために必要なツールを開発 ex vivoでライブイメージング
本手順の全体的な目的は、蛍光マーカーのライブイメージングをマウス胚の神経上皮スライス培養に統合することです。まず、誘導型Creマウス系統とCreレポーター系統を交配させ、可視的に分裂している細胞を遺伝学的に標識します。次に、マウス胚全体を解剖し、レンチウイルスの存在下でin vitro培養します。
次に、胚をスライスし、ライブイメージング用に神経管切片を調製します。最後に、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いて神経管切片を撮影します。これにより、ex vivo ライブイメージングを通じて、発達中の神経上皮内における単一細胞分裂をリアルタイムで直接観察した結果を得ることができます。
本プロトコルの強みは、個々の細胞をin vivoでモニタリングでき、それによって各細胞のシグナリングイベントおよび挙動に関する問いを立てられる点にあります。まず、タモキシフェン誘導性Creマウス系統であるCAGG CRE ERと、DS Red Creリポーター系統を交配させます。娘細胞におけるsonic hedgehog応答の相対的なタイミングをモニタリングするには、CAGG CRE ER ds red系統とOG two EEGを交配させてください。
FPバックトランスジェニックマウスにおいて、タモキシフェンを100% Ethanolに溶解し、胚細胞のごく一部でCRE発現とDS redラベル化を誘導するため、妊娠E 6.5の雌マウスに腹腔内投与した。48時間後、胚を摘出し、蛍光顕微鏡を用いてDS red陽性胚を特定した。これらの胚を培養皿に移し、ex vivoイメージング中に単一細胞分裂を観察した。
E 8.5胚を、10%新生仔牛血清および1%ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したD-M-E-M-F 12の1:1混合溶液を含む、予熱済みの洗浄液中で解剖します。ステージ温度を37°Cに設定した蛍光顕微鏡を使用するか、または37°Cのホットプレートの傍らで作業し、胚がGFPおよび/またはDS RED陽性であるか直ちに確認します。最大2個の胚を、あらかじめ平衡化した500 µLの培養液のドロップに移します。
蒸発を防ぐため、培地の上に平衡化したライトミネラルオイルを薄く重ね、胚を含む培養皿を37 °C、5% carbon dioxideの条件下でインキュベートします。神経上皮の繊毛を標識するために、胚を含む500 µLの平衡化した培養液の滴に、S sst, R 3G FP レンチウイルス(約200万バリアント)を5〜10 µL添加します。18時間培養後、感染させた胚を数滴の洗浄液に移してウイルスを洗浄し、神経管スライスを調製します。
胚を1%アガロースコーティング済みのディッシュに移し、0.025 mmのマイクロナイフを用いて神経管を切り出します。フェノールレッドを含まず平衡化した培養液150 µLを、35 mmのポリリシンコーティング済みガラスボトムディッシュに滴下し、切り出した神経管の腹側を下にして配置します。培養液の滴の中で、固定した神経管の周囲に पेट्रोलियम jelly と溶かしたキャンドルワックスを1:1で混合したものを少量置き、ガラスカバーのスリップをジェリーに優しく押し当ててサンプルを固定します。
イメージングのために、ディッシュを平衡化した薄いライトミネラルオイルの層で覆います。37 °Cおよび5% carbon dioxideに設定された環境チャンバーを備えた倒立共焦点顕微鏡を使用します。GFPラベルされたCLIAおよびDS red陽性細胞のイメージングには、60 xオイル浸漬対物レンズおよび40 xオイル浸漬対物レンズを使用します。
LICのGFP陽性およびDsRed陽性細胞をモニタリングするために、NIS-Elementsソフトウェアを開き、タイムラプスイメージング条件を設定します。10分ごとに、厚さ25 µmまで、間隔1.5 µmでZスタックを取得します。40倍対物レンズを使用する場合、および60倍対物レンズで厚さ8 µmまで、間隔0.4 µmでスタックを取得する場合は、詳細な手順についてテキストプロトコルを参照してください。
組織を固定しOCTに包埋した後、クリオスタットを用いて切片を作成し、テキストプロトコルに従って免疫蛍光染色を行います。ここでは、個々の細胞を標識するために、マウス胚8.5日の神経上皮内における単一細胞分裂のex vivoライブイメージングを行いました。組換え後にDS redを発現するCreレポーターラインを含む細胞のサブセットでCREリコンビナーゼを誘導しました。ここに見られるように、48時間後、Sonic hedgehog転写レポーターを導入した改良型バックトランスジェニックoli2 EGFPラインを用いることで、ex vivoイメージングにより単一細胞の分裂が観察されました。
細胞がSonic hedgehogに応答し始めたタイミングをモニターすることで、CLIA形成を観察することができました。SSTR 3G FPレンチウイルスを作製し、培養胚への感染に使用しました。EG two EGFPを発現するDS Red Creeレポーター胚、またはin vitro培養中にSSTR 3G FPレンチウイルスを感染させた胚のタイムラプス共焦点イメージングの結果をここに示します。この手法の強みのひとつは、背景に変異遺伝子アレルを組み込めることであり、これにより特定の遺伝子が個々の細胞挙動やシグナル伝達イベントにどのような影響を与えるかを検討することが可能になります。
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この研究は、マウスのE8.5の神経上皮における単一の細胞分裂を追跡するためのex vivoのライブイメージングのためのツールを開発します。ライブイメージングと胚のスライス培養の統合により、細胞プロセスのリアルタイム観察が可能になります。
Direct ex vivo live imaging of single cell divisions in mouse neuroepithelium enables high-resolution tracking of cell fate, signaling response, and subcellular events in a physiologically relevant context. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence at early discovery inflection points, particularly for neurodevelopmental target validation and pathway interrogation. The approach is adaptable for diverse genetic backgrounds and fluorescent markers, enhancing its portfolio-wide utility in preclinical neuroscience R&D.
This ex vivo imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing, target validation, and mechanistic studies in neuroepithelial systems.