でGFP標識タンパク質のイメージングを生きるショウジョウバエ卵母細胞

このプロトコルでは、GFPタグ付きタンパク質を発現する細胞を雌のショウジョウバエから解剖し、生細胞内のタンパク質の動きを研究するために画像化します。まず、スライドに2枚のカバースリップをシリコングリースで貼り付けてチャンネルを形成し、覗き室を準備します。チャネルの側面はハロカーボンオイルで裏打ちされています。

次に、女性からの卵巣をカバースリップにハロカーボンオイルの滴に解剖します。次に、個々の細胞を分離し、準備したスライドのチャネル上でカバースリップを反転させて、観察チャンバーを作成します。明視野またはDIC光学系で細胞を同定した後、共焦点顕微鏡と関連ソフトウェアを使用して、設定された時間間隔でデジタル画像をキャプチャします。

最終的には、生成された画像のタイムラプスシーケンスを使用して、生細胞内のタンパク質または粒子の経時的な動きを監視できます。この方法は、タンパク質やmRNAの輸送、細胞極性の確立など、細胞生物学および発生生物学の主要領域を調査するのに役立ちます。まず、生後1週間未満の健康なハエに麻酔をかけ、腹部が丸みを帯びたクリーム色の大きな雌を10〜15匹選びます。

選択したハエと数匹のオスを、新しい軽く酵母の食品が入ったバイアルに移します。その後、ハエを摂氏25度で2日間孵化させて太らせます。ハエを肥育させることで、さまざまな段階、特に第8段階から第12段階が、肥育していないハエや肥育不良のハエのイメージングに利用できることが保証されます。

標準的なスライドガラスに約1cm間隔で2枚のカバースリップを貼り付けます。カバースリップとスライドの間にしっかりと密閉されるのに十分なグリースのみを使用してください。各カバースリップをしっかりと押し下げて、グリースを薄く均等に広げます。

次に、カバースリップとスライドの間の接合部にハローカーボンオイル27をいくらか加えて、後続のステップで単離された細胞を傷つけないようにする。次に、22平方ミリメートルのカバースリップの表面に2〜3滴のカーボンオイル27を置きます。次に、口は、食品バイアルから個々の女性をピペットでピペットし、ハローキャロンオイルに穏やかに沈着させます。

鋭利な解剖鉗子を使用して、フライをカバースリップに固定し、腹部の先端を引き抜きます。卵巣をオイルの下のカバースリップの表面に沿って引きずって卵巣を取り出し、カバースリップへの細胞の接着を促進します。次に、卵巣をそっと引き離し、卵形成の少なくともステージ10Bである細胞を探します。

この段階で卵子を特定するには、卵子が卵室の総体積の少なくとも50〜60%を占める卵室を探します。鉗子を使用します。1〜3人の女性を使用して、個々の卵子を卵巣鞘から除去します。

カバースリップ上の5〜8個の損傷していない卵子を引き続き分離します。次に、使用できないティッシュをすべて取り除きます。卵子を含むカバースリップを事前に準備したスライド上に慎重に反転させ、細胞が2つのスペーサーの間に位置します。

また、必要に応じて細胞を損傷する可能性があるため、カバースリップを押し下げないでください。サンドイッチの端に少量のハローカーボンオイルを追加して、スペースが満たされていることを確認します。卵形成のこの時点で、卵子を覆う卵胞細胞は、ナース細胞への接続が残っている小さな領域を除いて、すべての側面で卵子を囲むようになっています。DICまたは位相差光学系を使用して卵子に焦点を合わせます。

卵子に、細胞質の漏出や卵胞細胞の膨らみなどの損傷の兆候がないか調べます。健康で損傷を受けていないように見える卵子のみを画像化します。GFPラベル付けなしでストリーミングを直接監視します。

スコープのZI範囲でキャプチャ画像を設定し、GFP標識タンパク質に使用されるものよりも高いゲイン設定を行います。エア対物レンズを使用して、サンプルのドリフトと動きを大幅に最小限に抑えます。卵母細胞の表面のすぐ下にある光学切片を取得します。

関心領域にピントが合ったら、明視野光学系をオフにし、ソフトウェアの高速スキャンプレビュー機能を使用して共焦点イメージングに切り替え、必要に応じてフォーカスとゲインを調整します。また、励起、波長、および発光波長のパラメータを設定します。Z 軸のキャプチャでは、フレーム間に 10 秒の遅延がある一定の Z 軸を選択します。

20〜50フレームの一般的なタイムラプスシーケンスをキャプチャしたら、すぐにビデオ品質を確認して評価します。この 1 つのタイム ラプス画像は、ステージ 11 の卵子を示しています。GFPタグ付きタンパク質R TNLを発現するこの卵子は、強いシグナルを生成することができます。

R TNLは、OPプラズマストリーミング中に存在する長い微小管と共局在しているようです。典型的には、野生型卵室でのOPプラズマ流は、ステージ10Bの卵室の最大5フレーム投影で示される自己蛍光ylk小胞の顕著な動きとして明らかである。このビデオを見れば、GFPタグ付きタンパク質を発現する健康な女性細胞を単離する方法、ライブイメージング用のサンプル調製方法、蛍光タンパク質や粒子のタイムラプスビデオの撮影方法について十分に理解できるはずです。