成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

この手順の全体的な目標は、成体マウスのEDL筋から単一の生繊維とそれに関連する幹細胞を単離して培養することです。これは、最初に、繊維を損傷しない腱間解剖手順を使用してEDLを解剖することによって達成されます。次に、筋線維幹細胞連合を維持しながら繊維を解きほぐすために筋肉消化が行われますが、これはこのプロトコルのユニークなステップです。

最終ステップでは、個々の筋線維を互いに穏やかに分離し、破片や過度に収縮した線維を連続洗浄で除去します。最終的に、この技術によって単離された筋線維は、最小限の活性化刺激で半静止状態に保つか、サテライト細胞の活性化と分化を研究するために高血清培地で培養することができます。近年、培養マイアファイバーの使用は、関連する生理学的ニッチにおけるサテライト細胞の活性化、増殖、および分化を研究するための非常に強力なアプローチとなっています。

このアプローチにより、これらの細胞の機能を分子レベルおよび細胞レベルで理解する上で、大きな前進を遂げることができました。EDLを単離するマウスごとに、5つのプラスチック製の60mmシャーレに馬血清ピペットをコーティングし、4mmの馬血清を皿に置き、それを渦巻かせて均一にコーティングします。次に、残った血清を吸引する馬の血清を取り除き、皿を少なくとも30分間乾かします。

30分後、4つの皿に4ミリリットルの洗浄剤を追加します。皿に次のようにラベルを付けます、消化後の筋肉、1つ、2つ、3つを洗います。残りの繊維培養皿に4ミリリットルの繊維培養培地を追加します。

使用前に、皿を摂氏37度で5%二酸化炭素インキュベーターに保管してください。次に、1つのファイバー単離のために、顕微鏡下で2つの滅菌ピペットを調製します。小口径ピペットをダイヤモンドペンでカットして、筋肉全体が洗い流されるのに十分な大きさの開口部になるようにして、大口径ピペットを作ります。

2番目のピペットは、MyFi操作用の小口径ピペットです。次に、ピペットに火をつけて端を滑らかにし、小口径ピペットの先端であるフレームカーブを使用して滅菌します。これは、分離中に単一ファイバーを処理するのに役立ちます。

次に、両方のピペットを馬の血清でコーティングします。最後に、顕微鏡ステーションと解剖ツールを70%エタノールで必ず清掃してください。このデモンストレーションでは、8週齢のトランスジェニックSV 1 29マウス。

安楽死させられた。後肢に70%エタノールをスプレーします。次に、動物を上向きにサポートボードに固定します。

これは、後肢をよりよく把握するために必要です。次に、手足の全長を切り取り、下にある筋肉を露出させます。皮膚だけでなく、髪の毛や毛皮も取り除きます。

細いハサミを使用して、下にある組織に損傷を与えることなく、筋肉を囲む薄い筋膜を切り抜きます。TAとEDLの両方の遠位腱を鋭利なcohan Vanaを使用して露出させます。春はさみ。

EDLとTAの両方の遠位腱を切断します。次に、鉗子を使用して、TA筋とEDL筋の両方を腱で保持し、筋肉を近位端に向かって繊細に引き上げます。この時点で、TA筋のすぐ下にあるEDL筋がはっきりと見えるはずです。

次に、2つの腱を反対方向に引っ張ることにより、EDLをTA筋から分離します。この操作を実行している間、EDL筋肉を伸ばさないでください。これは筋線維を損傷するので。

EDL腱を露出させます。この時点で、近位腱をよりよく視覚化するためにTA筋を取り除くことが役立つ場合があります。また、膝の周りの結合組織の一部を切り取るのにも役立つ場合があります。

腱がはっきりと見えるようになったら、鋭利なコーハンのヴィーナススプリングハサミを使用してEDLの筋肉を解放します。手順が正しく行われ、EDLがその細長い形を維持できるはずであれば、四肢から取り除いたら、EDL筋を腱を通して保持し、それを予熱した2ミリリットルのコラゲナーゼ溶液に移し、摂氏37度の水浴中でインキュベートします。このプロセスを繰り返して2番目のEDLを分離し、それを同じコラゲナーゼチューブに移して不均一な消化を行います。

2 番目の EDL の分離は、分離後 5 分以内に完了する必要があります。最初のEDLインキュベーション時間は、コラーゲン活性、筋肉の大きさ、動物の年齢、または筋肉の状態に応じて調整する必要がある場合があります。たとえば、線維性組織が多い筋肉は、より長いインキュベーション時間が必要になる場合があります。

また、この間の攪拌はS細胞を活性化することが示されています 消化時間中 定期的に筋肉をチェックして、過剰消化を避けてください。筋肉がほぐれ始め、筋繊維が見えてきたら消化を止めます。大口径ピペットを使用して、両方の筋肉を予熱済みのペトリ皿に慎重に移します。

4ミリリットルの洗浄媒体では、消化が過剰に収縮する筋繊維をもたらすため、消化を避ける必要があります。筋線維を放出するには、大口径のグラスピペットを使用して、繊維が自然に放出され始めるまで、温かい培地で筋肉を洗い流します。筋肉をT字型にしないでください、これは必然的に繊維を損傷する結果となるからです。

希望の数に達するまで、ミオファイバーの放出を続けます。皿を室温で10分以上放置しないでください。インキュベーターに5分間戻し、平衡化してからこれ以上作業を進めます。

現在、培養物には、長くて輝く管状構造である生きたシングルミオファイバーと、暗くて短くて破片であるハイパー収縮ファイバーの混合物が含まれています。スモールサイズのボアピペットを使用して、生きたシングルMYOPファイバーを新しいプレワームディッシュに移します。各myopファイバーを個別に取り扱ってください。

ミオファイバーの大部分を一度に移すのではなく、必要に応じて、ディッシュをインキュベーターに10〜15分間戻し、培地を再平衡化します。シングルマイオプファイバーをさらに2回移し、少なくとも3回連続して洗浄した後、死んだミオファイバーと破片をすべて取り除きます。生きたMyo繊維は、培養または下流の分析のために皿に残す必要があります。

生きた繊維は長い形態をしています。それどころか、過度に収縮した繊維は短くて太くなります。次に、単離したmyoファイバーを洗浄培地で少なくとも1時間インキュベートしてから、培地に切り替えます。

新しい予温皿では、高培地により、長時間の培養のためのサテライト細胞の活性化が可能になります。マトリゲルは、選択した媒体に関係なく適切である可能性があります。隔離の時間に隔日で交換してください。

各MyFiのサテライトセルは、光学顕微鏡で観察すると、筋線維表面に小さな隆起として現れます。ミオファイバーを血清に富んだ培地で長期間維持すると、培養物中に完全に分化したミオチューブが主に観察されます。MIFF five Cree Rosa YFPラインなどのレポーターマウス系統は、筋肉の再生過程を研究するのに最適なツールです。

Miff five Cree Rosa YFP繊維培養に由来するMyoチューブは、MIFF 5レポーターYFPを表現しました。これは、筋肉の再生にはMiff fiveの活性化が必要であることを示唆しています。PAX seven Cree TDトマトマウス株は、別のレポーターラインです。

TDトマトの蛍光シグナルは衛星細胞のみで検出され、myONの核は明らかに陰性です。このことは、転写因子PAX sevenが筋幹細胞によって特異的に発現し、その分化した子孫によって発現しないことを示唆しています。Myoファイバーとそれに関連するサテライトセルは、下流用に固定できます。

免疫蛍光PACの7つの陽性myo D陽性サテライト細胞は、古典的には増殖性献身筋前駆細胞と考えられています。彼らは、私のOD発現を維持しながらPAC 7をダウンレギュレーションすることで分化プログラムを完了するか、ODをダウンレギュレーションしてPAC 7の発現を維持することで静止状態に戻るかのどちらかです。シングルファイバーアイソレーション技術は、生理学的なMyofiberサテライト細胞協会を保存するというユニークな特徴を持っています。

この手順の最も重要なステップは、腱から腱へのEDL筋の解剖です。また、ファイバーの操作を最小限に抑えることで、ファイバーの完全性と生存率を維持することができます。シングルマイオプファイバーの分離が成功するかどうかは、コラーゲン活性、筋肉の状態、年齢など、いくつかの要因に左右されます。

最も重要なことは、腱から腱への筋肉の分離により、繊維の完全性を維持できることです。また、手順全体での繊維操作が最小限に抑えられるため、生存率が向上します。