モスキートガットメタゲノムRNA-seqのためのリボソームRNAの枯渇
2013年4月7日
リボソームRNA（rRNA）の枯渇プロトコルは蚊腸metatranscriptomeのRNA-seqのためのメッセンジャーRNA（mRNA）を豊かにするために開発されました。引き算を介しrRNAを除去するために使用されたサンプル特定のrRNAプローブは、蚊とその腸内微生物から作成されています。プロトコルのパフォーマンスは、rRNAの約90から99パーセントの除去をもたらすことができます。
みなさん。ニューメキシコ州立大学生物学部のXenon Zu博士研究室のFana Klaです。私たちは、蚊の腸内生態系のメタゲノミクスに取り組んでいます。
本日は、総RNAサンプルからリボソームRNAを枯渇させ、RNA-SeqのメッセンジャーRNAを濃縮するAプロセスを実演します。RNA-Seqは、微生物群集の機能を研究するために広く使用されている手法です。まず、筋腸からトータルRNAとメタゲノムDNAを分離する方法をお見せします。
Analysガンビアの蚊は、セクターで維持されています。蚊は最初に砂糖ミールを餌として与えられ、次に雌の蚊がマウスに与えられてACHE生産が行われます。これらの蚊には砂糖が与えられ、ネズミの血が与えられます。
手順の前に、すべての解剖ツールとスライドが滅菌されました。蚊は、ペトリ皿で70%エタノールで3回表面洗浄され、エタノールを乾燥させるためにガラススライドに戻され、蚊を別のスライドガラスに置き、滅菌された1つのXPBS溶液を一滴入れます。次に、腸をそっと引き出します。
蚊の腸は、それぞれメタゲノムDNAと全RNAを取得するために使用されます。RNAの作業を始める前に、手袋を着用してリボヌクレアーゼを含まない環境を維持し、作業エリアのピペットや必要なすべての装置を樹液で洗浄することにより、RNAの分解を回避するための標準的な予防策を講じることが重要です。手順の前に、50個の腸を採取し、PU試薬を含む1.5ミリリットルのeinorチューブに入れます。
全RNA単離ゲノムでは、メタゲノム単離キットを使用して、50個の腸の別のバッチからDNAを単離します。RNAまたはDNAの濃度は、NanoDropを使用して測定されます。RNAサブトラクションを使用して、全RNAサンプルからリボソームRNAを除去しました。
まず、腸サンプルから採取したゲノムDNAから、サンプル特異的なRRNAフラグメントをPCR増幅します。PCR産物は、Qiagen PCR精製キットを使用して精製されます。このステップでは、T seven RNAポリメラーゼを使用してアンチセンスRRNAプローブを合成します。
ステップ1のPCR産物とビオチン化CTPおよびUTPを用いて反応を調製します。次に、反応を摂氏37度で一晩インキュベートします。これで、アンチセンス RRNA プローブを RRNA の枯渇に使用する準備が整いました。
このステップでは、ビオチン化 RRNA プローブを使用して、トータル RNA サンプル、ターゲット RRNA、および RRNA プローブ中のターゲット RRNA を捕捉します。次に、ハイブリッドは、連鎖球菌がコーティングされた磁気ビーズを分割することによって捕捉されます。ハイブリダイゼーション反応をPCRチューブにセットし、サーマルサイクラーで摂氏70度で5分間インキュベートします。
次に、温度を摂氏25度に下げます。反応が進行している間にRRNAハイブリダイゼーションを可能にするために、ビーズを調製します。まず、アリコートを3つ作ります。
チューブあたり100マイクロリットルのビーズを使用。ビーズを1つのXSSC溶液で3回洗浄します。次に、チューブを氷の上に置きます。
反応の準備ができたら、100マイクロリットルのXSSCを20%フォームアミドで加えて希釈します。反応溶液をビーズでチューブに移します。よく混合し、室温で10分間インキュベートします。
チューブを時々フリックし、チューブを短く回転させて磁気ラックに置きます。スーパーナチンをコレクションチューブに移します。ビーズを100マイクロリットルでさらに2回洗います。
XSSC バッファー溶液を 1 つ追加しました。よく混ぜてから、磁気ラック上のビーズを再度捕捉します。上清を収集チューブに移します。
これで、チューブ内にRRNAが枯渇したRNAサンプルができました。QiagenのRNイージーミニキットを使用して精製を行います。指示に従って、今度は枯渇の効果を確認しています。
RNAサンプルはAgilent RNA 6, 000 PICOチップにロードされ、2100バイオアナライザーを通過します。減算前。リボソーム RNA のピークは 2 つあり、それぞれ 16 秒と 23 秒でした。
減算後、RRNAピークは効果的に除去されました。残りのRNAは、200塩基対から4キロ塩基までのサイズ範囲にあります。これで、RNAサンプルはトランスクリプトームシーケンシング用のCDNAライブラリを作成する準備が整いました。
メッセンジャーであるRNAを濃縮する手順をご案内します。探す。ご視聴いただきありがとうございます。
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概要
この記事では、RNA配列決定（RNA-seq）のために蚊の腸サンプルからメッセンジャーRNA（mRNA）を豊富にするためのリボソームRNA（rRNA）を枯渇させるためのプロトコルを提示しています。この方法は、サンプル特異的なrRNAプローブを使用してrRNAを効果的に除去し、約90-99%の枯渇率を達成します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- メタゲノミクス
- RNA配列決定
- 微生物生態学
背景
- 蚊の腸内エコシステムを理解することは、ベクター媒介疾患の研究にとって重要です。
- RNA-seqは微生物群集の機能を分析するための強力なツールです。
- リボソームRNAは総RNAの大部分を占めており、mRNA分析を複雑にしています。
- 効果的なrRNA枯渇はRNA-seqデータの品質を向上させます。
研究の目的
- 蚊の腸内メタ転写体分析のための信頼できるrRNA枯渇プロトコルを開発すること。
- 後続のRNA-seqアプリケーションのためのmRNAの豊富さを改善すること。
- 蚊の腸内の微生物群集の理解を促進すること。
使用した方法
- 蚊の腸サンプルからの総RNAとメタゲノムDNAの分離。
- rRNA枯渇のためのサンプル特異的なrRNAプローブの設計と適用。
- 定量的分析を通じたrRNA除去効率の評価。
- RNA-seq分析のための豊富なmRNAの調製。
主要な結果
- 開発されたプロトコルは、総RNAサンプルから90-99%のrRNAを成功裏に除去しました。
- 豊富なmRNAサンプルはRNA-seqの品質が向上したことを示しました。
- この方法は様々な蚊の種とそれらに関連する腸内微生物に適用可能です。
- 結果は蚊の腸内メタ転写体についてのより深い理解に貢献します。
結論
- rRNA枯渇プロトコルは蚊の腸サンプルからmRNAを豊富にするための効果的です。
- この進歩は蚊の微生物群集に関する将来の研究を強化します。
- さらなる研究はこれらの発見に基づいて腸内の生態学的相互作用を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient depletion of ribosomal RNA from mosquito gut metagenomic samples enables high-fidelity transcriptomic profiling of complex microbial communities. This capability is critical for target validation and mechanistic de-risking in vector-borne disease research pipelines. The protocol supports predictive confidence in early discovery and translational studies by ensuring quantitative mRNA analysis from challenging biological matrices.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial gene expression relevant to mosquito physiology and vector competence.
- Supports functional target validation by clarifying microbial contributions to host traits.
- Facilitates mechanistic de-risking through accurate transcriptomic readouts.
Screening & Assay Development
- Prepares rRNA-depleted RNA suitable for standardized RNA-seq workflows.
- Improves assay reproducibility by minimizing rRNA interference in downstream analyses.
- Enables quantitative assessment of microbial mRNA for reliable compound or intervention screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns metatranscriptomic data with disease-relevant models for translational biomarker discovery.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling robust microbial gene expression profiling.
- Reduces biological ambiguity in preclinical decision-making for vector-targeted interventions.
Pipeline & Workflow Integration
This rRNA depletion protocol integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing high-quality RNA inputs for transcriptomic and functional genomics workflows.
- Discovery Biology: Enhances hypothesis testing by enabling comprehensive microbial transcriptome analysis.
- Screening: Delivers rRNA-depleted RNA for reproducible, quantitative RNA-seq assays.
- Analytics: Provides clear mRNA readouts, supporting statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and mechanistic insights in disease-relevant mosquito models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol adaptable to diverse metagenomic and host-microbe systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial transcriptomics.
- Operational Value: Standardizes RNA preparation for scalable, reproducible RNA-seq workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling robust target and pathway validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of vector-targeted discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling and metagenomic sample preparation.
- Needs access to PCR, in vitro transcription, and magnetic bead-based separation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for probe design and depletion efficiency assessment.
- Adaptable to various mosquito species and microbial communities with protocol optimization.
- Effectiveness depends on probe specificity and careful RNA quality control.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:02
Title
0:08
Introduction
0:48
Mosquito Rearing
1:31
Mosquito gut dissection
1:43
Metagenomic DNA and RNA isolation
2:27
Ribosomal RNA depletion
2:34
PCR amplification of rRNA gene fragments
2:48
In vitro transcription of rRNA probes
3:19
rRNA subtraction
3:39
Removal of rRNA
5:07
Representative results
5:48
Conclusion
