プライマリマウス大腸腫瘍のin vitroオルガノイド培養で

この手順の全体的な目的は、一次ニューロン結腸腫瘍オルガノイドを確立することです。これは、最初にマウス結腸腫瘍組織を収集することによって達成されます。2番目のステップは、隣接する正常な結腸上皮を解離することです。

次に、結腸腫瘍細胞を単一細胞に消化します。最後のステップは、結腸腫瘍細胞をマトリゲルに埋め込み、限られた栄養条件でそれらを選択的に培養することです。最終的に、光学顕微鏡法を使用して、結腸腫瘍オルガノイド形成の時間経過を示します。

この技術が、形質転換結腸がん細胞株などの既存の方法よりも優れている点は、オルガノイド培養がin vivoの状態を厳密に模倣し、より生理学的に関連性のあるデータを生成することです。マウスを二酸化炭素で安楽死させ、結腸を採取した後、結腸をPBSで洗い流します。はさみを使用して結腸を縦方向に開き、次に実体顕微鏡の下に置き、はさみを使用して腫瘍を含む領域を取り除きます。

腫瘍組織をPBSで収集して洗浄します。洗浄後、腸の断片をEDTAキレート化に移し、緩衝液を緩衝し、キレート化後60分間氷上でインキュベートすると、正常な腸上皮細胞の大部分が剥離し、腫瘍細胞はメカイに付着したままになります。正常な上皮細胞を含むキレート化緩衝液を吸引し、残りの腫瘍断片を洗浄します。

もう一度。5ミリリットルのコールドキレート緩衝液付き。キレート化緩衝液を吸引した後、腫瘍片を5ミリリットルの冷たいXPBSで洗浄します。

1つのXPBSを吸引した後、組織断片に消化バッファーを加え、2時間インキュベートします。摂氏37度で、腫瘍の断片を通常の重力で1分間沈殿させ、その後、S上清を15ミリリットルの遠心分離管に集めます。単一細胞腫瘍懸濁液をGの200倍で3分間遠心分離することにより、スペイメントします。

次に、5ミリリットルのPBSで一度洗浄し、遠心分離機にかけます。再度、500マイクロリットルのPBSで腫瘍ペレットを再懸濁します。次に、ヘモサイトメーターを使用して単離された単一腫瘍細胞をカウントします。

次に、Gの200倍で3分間遠心分離して腫瘍細胞を巻き取り、氷上で1ミリグラムあたり5ミリグラムのマトリゲルを再送します。次に、24ウェルプレートのウェルあたり50マイクロリットルのマトリゲルに15, 000個の細胞をプレートします。マトリゲル細胞混合物を37°Cで15分間重合させた後、各ウェルに尿中EGF50ナノグラム/ミリリットルを含む基礎培養液500マイクロリットルを加え、EGFを含む基礎培養液を2日ごとに交換し、オルガノイドを週1回1〜5個マッサージしてマッサージする。

培地を新鮮な基礎培地と交換した後、ピペットチップをカットしたP 1000ピペットを使用して、オルガノイドとマトリゲルを機械的に破壊します。オルガノイド懸濁液を15ミリリットルのファルコンチューブに移します。ファイヤーポリッシュされたパスタピペットを使用して、オルガノイドをさらに混乱させます。

解離したオルガノイドを5ミリリットルの基礎培養液で洗浄し、培地およびGの200倍を2分間遠心分離します。その後、サピネートを廃棄し、前述のようにマトリゲルとプレートでペレットを再懸濁し、オルガノイドを凍結し、解離洗浄し、遠心分離します。前と同様に、仰臥位を捨てて再燃させます。

ペレットを20%のウシ胎児血清と10%のジメチルスルフオキシドを含むDMEMに懸濁します。.次に、細胞懸濁液を1.5ミリリットルのクライオチューブに移します。チューブを Nalgene Mr.Frosty 冷凍容器に移し、マイナス 80 度の冷凍庫で保存すると、1 分間にマイナス 1 度の冷却速度が得られます。

一晩インキュベートした後、細胞を液体窒素に移します。細胞は、この方法で2年以上保存することができます。RNA抽出のために、細胞が収集されます。

継代に関しては、ピコピュアRNA単離キットを使用してRNAを単離します。タンパク質抽出の製造元の指示書によると、細胞ペレットは通常の方法で収集され、その後、免疫組織化学用の100マイクロリットルのラジオ免疫沈降アッセイバッファーに入れられます。細胞培養培地を吸引した後、カットしたP 1000ピペットを使用して、腫瘍オルガノイドをクライオモールドに移します。

型をドライアイスの上に置き、組織凍結培地を型に加え、7ミクロンで凍結切片を切断し、染色 以前に発表されたプロトコルによれば、この画像は、3ヶ月齢のPC最小マウスから採取した結腸腫瘍に由来する代表的なオルガノイド形成を、めっき後しばらくで示しています。この画像は、めっき後の1日後の同じオルガノイドを示しています。ここでは、オルガノイドが3日間培養されています。

この画像は、めっきの6日後のオルガノイドを示しています。ここでは、14日間培養された2つのオルガノイドが示されています。この段階では、各オルガノイドは細胞のクラスターで構成されていることに注意してください。

このヒストグラムは、2つの異なるコラゲナーゼ消化条件下でのオルガノイド形成の成功率を示しています。これらの画像は、生後3ヶ月のPCマウスから採取した結腸腫瘍に由来するオルガノイドで、β-カテニンの免疫蛍光染色を行ったものです。DPIは核の染色に使用されました。

このビデオを見た後、酵素消化によって原発性尿結腸腫瘍OIDを確立する方法についてよく理解しているはずです。