マイクロコンピュータ断層撮影イメージング用Microfilで虚血後肢と血管系の灌流に浸透ドラッグデリバリー

この手順の全体的な目標は、マウスの虚血性後肢への局所物質送達のための浸透圧ポンプのin vivo挿入と、その後のマイクロコンピュータ断層撮影イメージングのためのマイクロフィルによる後肢血管系灌流を実証することです。これは、最初に実験動物の肩と後肢を切開して、動物の背中の内側に沿ってシースチューブをトンネル化できるようにすることによって達成されます。第2ステップでは、充填されプライミングされた浸透圧ポンプとカテーテルがチューブを通して挿入され、ポンプが動物の背中に縫合されます。

次に、チューブを取り外します。大腿動脈は大腿骨分岐部の近位に二重結紮され、切開部は縫合されます。その後、ヒンディン血管系にマイクロフィル、シリコンラジオピックイメージング剤を注入します 腹部下大動脈カテーテルを通して。

最終的には、マウス虚血性後肢の血管円柱の3D画像をマイクロフィルで可視化することができます。テキサス心臓研究所の分子心臓病学研究所の所長であるリチャード・ディクソン博士です。当研究室では、心血管疾患や末梢血管疾患の治療のために、様々な細胞治療薬や薬剤療法を開発しています。

末梢血管疾患における化合物の試験の最も一般的なモデルの1つは、動物のげっ歯類の後肢虚血モデルです。最近、このモデルにいくつかの重要な進歩が加えられましたので、このビデオプレゼンテーションではそれらをご紹介したいと思います。この技術の主な利点は、毎日の薬物注射のような既存の方法よりも、この技術が動物の取り扱いと保険の必要性を減らすことです。

開始期間中、物質の継続的な局所投与。さらに、マイクロフィルキャスト血管のマイクロCTイメージングは、マイクロCTがサンプル全体の血管性を代表する真に定量的で容積測定的な3次元分析を行うことができるため、組織学的またはレーザードーパー増殖イメージングよりも有利です。滅菌技術を使用して、空のポンプの重量を量り、その重量をミリグラムで記録することから始めます。

次に、1 CC シリンジと先端が鈍い 27 ゲージ充填チューブを使用して、ポンプに PBS をゆっくりと充填します。PBSがポンプの上部に達したら、充填を停止します。余分な溶液を拭き取った後、充填されたポンプの重量を量ります。

次に、一対の鉗子を使用して、白いフランジを流れから切り離します。モデレーターは、チューブを曲げたり押しつぶしたりしないように注意し、モデレーターの両端の3〜4ミリメートルをP50カテーテルで覆います。次に、シリンジを使用してカテーテルを満たし、モデレーターはシリンジをカテーテルの遠位部分に取り付けたままにします。

フローモデレーターをポンプに挿入し始めます。カテーテルがポンプ表面と同じ高さになったら、シリンジをカテーテルから取り外し、ポンプを摂氏37度のPBSで一晩インキュベートします。.手術当日は、完全に鎮静した腹臥位のマウスに眼軟膏を塗布し、次に動物にイソフッ素の連続的な流れをもたらすフィットした鼻円錐を配置します切開部位に麻酔薬を注射した後、ポビドンヨード溶液と続いて70%エタノールで皮膚を治療します。

次に、脊柱の側面にある肩甲骨領域に4〜6ミリメートルの切開を行います。細い鉗子を使用して皮下膜を分離します。次に、マウスを仰臥位にした後、顕微手術用ハサミを使用して、大腿動脈の経路に従って膝上を大腿部内側に向かって0.8〜1センチメートルの切開を行います。

次に、小さなシースチューブを使用して、胴体の内側から背中の切開部まで胴体の側面をトンネルで掘ります。次に、マウスを腹臥位に戻した後、プライム浸透圧ポンプのカテーテルをシースチューブを通して大腿部に導き、次にポンプを動物の背部の内側に配置します。6 oh prolene縫合糸で背中の切開を閉じます。

マウスを仰臥位に置いた後、もう一度シースチューブを取り外し、カテーテルを大腿部の切開部から露出させます。サージカルテープで脚を固定します。次に、リトラクターを使用して切開部を開き、皮下脂肪組織を分離して血管系を明らかにします。

次に、細い先のとがった鉗子を使用して、膜状の大腿骨鞘を優しく突き刺します。過度の出血を引き起こさずに血管束にアクセスするため。大腿動脈を大腿静脈と鼠径部近くの神経から慎重に解剖し、分離します。

次に、大腿動脈を中断するために、深部FMRIと上腹部動脈の起点にある大腿骨分岐部の近位に2〜3ミリメートルの2つの8 OH prolene隣接する縫合糸を配置します。次に、カテーテルを適切な長さに切断します。先端を大腿部の前外側領域に配置し、6.0プロレン縫合糸で先端を表在筋膜に固定します。

イメージングの準備として、麻酔をかけたマウスを仰臥位に置き、マウスを鼻円錐に取り付けた状態で動物の血管系の凝固を防ぐために、1000 IUのヘパリンナトリウムナトリウムを0.2cc皮下に注入します。腹部の臓器を動物の左側に移動した後、胸腔と下腹部が露出するのに十分な大きさの切開を行います。腹部下部大動脈を露出させるには、大動脈を下大静脈から慎重に分離します。

次に、近位の腎下腹部大動脈を結紮し、針先を使用して血管に小さな切開を行います。次に、P 10 カテーテルに取り付けられた 27 ゲージ半の鈍針を腹部下大動脈に挿入し、針を 6 OH 縫合糸で固定します。27 ゲージ半の針を固定した後、右心房を切開し、安楽死を誘発し、過剰な液体の排出を可能にするためにフッ素の過剰投与を投与します。

次に、ヘパリン化生理食塩水で満たされた20ccシリンジを針先に取り付け、血管系を少なくとも5分間洗い流します。フラッシングが始まったらノーズコーンを取り外すと、マイクロフィルの注入は手順の中で最も難しいステップです。成功を確実にするためには、すべての血液が航行で灌流後に血管から洗い流されることを確かめることが重要です、今、ホルマリン充填された20ccの注射器をカテーテルに取り付け、さらに5分間血管を罠に圧力

最後に、マイクロフィルを容器に5分間ゆっくりと灌流します。マイクロフィルを投与する際には、最適な容器鋳造を実現するために、一定の圧力をかけるように注意してください。オプションで、この時点で皮膚を解剖して、マイクロフィル充填された血管系を表示し、さらに顔の分析を行うことができます。

造影剤の重合には、動物を10%NBFで満たされた容器に入れ、24時間後に摂氏4度で保存します。解剖ツールを使用して、下腹部大動脈の遠位の皮膚を切除します。NBFをリフレッシュし、動物を室温で容器に戻します。

4日後、骨の脱灰を促進するために、反対側および虚血性の後肢を解剖します。試料をギ酸溶液に48時間置き、その後、流水で1時間すすぎます。最後に、検体を10%NBFに戻し、フロンおよびマイクロコンピューター断層撮影イメージングを進めます。

この最初の図は、大腿動脈の外科的結灌前と外科的結灌の血液ドップラー画像の代表的なレーザードップラー画像を示しています。マウスでは、マイクロフィルによる血管キャスティング後の矢印で示されるように、左後肢に虚血が生じ、血管ネットワークの3Dマイクロコンピュータ断層撮影画像は、マイクロフィルが血管を効果的に満たすことができることを示しています。ただし、気泡、圧力不足、マイクロフィルの粘度など、さまざまな手続き上の要因により不連続性が発生する可能性があり、不連続性のポイントは矢印で示されています。

このビデオを見た後、虚血手術後に喘息ポンプを使用してマウスの後肢に物質を安定して送達する方法をよく理解しているはずです。