Name: 初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学ぶライブセルイメージングによるオートファジー動態解析。HEK293T細胞を用いてGFP-DFCP1とCFP-LC3マーカーでオメガゾーンからオートファゴソーム形成をリアルタイム観察し、リソソームとの融合過程を解明する方法です。

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私たちの仕事は、バイオテクノロジー·生物科学研究評議会によってサポートされています。私たちは、親切にCFP-LC3の発現用プラスミドを私達に供給するための教授吉森保に感謝したいと思います。

1。細胞調製<ol><li> （2の後の80％の密集度を目指す30〜40％のコンフルエントになるまで、ダルベッコ改変イーグルの培地（DMEM）中で一晩培養細胞、HEK-293T細胞の種低継数が安定的に22ミリメートルの円形のカバースリップ上GFP-DFCP1を表現日 - ライブセルイメージングの日）。 </li></ol> 2。細胞トランスフェクション<ol><li>私は血清培地、3μl​​のX-tremeGENE 9 DNAトランスフェクション試薬、及びpECFP-LC3プラスミドDNA0.5μgのを減少させ、100μlのOptiMEM中を含む、各プレートのためにトランスフェクション複雑なミックスを調製する。とを上下にピペッティングにより穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートする。 [注：我々は何度もそのようなリポフェクトアミン2000などの他のトランスフェクション試薬は、毒性の多くを持っていることを発見した、そして、それに加えて、彼らは多くの顕微鏡技術と干渉し、自分の上に蛍光粒子を生成します。] </li><li>プレートから培地を吸引し、新鮮なDMEM予め温め37℃を追加</li><li> TRANを追加ピペッティングにより細胞への複雑なsfection、24時間インキュベートした細胞。 </li></ol> 3。オルガネラマーカー（オプション）を持つセル·インキュベーション<ol><li> 75 nMの最終濃度DMEMにmitotracker / lysotrackerを追加し、露光、繰り返し凍結融解サイクルを避けるために、全体の実験日に沿って、アルミホイルで覆いファルコンチューブに、氷上で保持する。 </li><li> mitotracker / lysotracker含有培地2mlのアリコートを取り出し、37℃で温める。トランスフェクトした細胞から吸引培地とmitotracker / 30用培地とインキュベート細胞含有lysotrackerと交換 - 60分。 </li></ol> 4。生細胞イメージングのためのインキュベーションチャンバー（図1）の調製<ol><li>きれいな金属、75％エタノールでOリングプラスチックと金属Oリングのリム上にシリコングリースを塗布してください。 </li><li> 、プレートからカバーガラスを除去し、カバースリップの下側から媒体の過剰の乾燥鉗子を使用してこれは漏れの可能性を増加させるように、グリースが多すぎる培地を混合しないようにします。 </li><li>密閉チャンバーを作成するために、プラスチック製のOリングの棚の上に休ませ、その間に挟まれたカバースリップで、プラスチック製のOリングの上に金属製のOリングに合うようにカバースリップのままにしておきます。 </li><li>プレートから媒体とチャンバアップトップ、この点から上に、DMEMの重炭酸塩緩衝系は人工的なCO 2濃度を必要とするように、発生するpHの変化を防ぐために、緩衝剤を含まないDMEM培地での細胞の長期のインキュベーションを避ける5〜10％の、周囲の空気のCO 2濃度が非常に低い。 </li></ol> 5。細胞の飢餓<ol><li>顕微鏡ステージ上でインキュベーションチャンバーを置く。 </li><li>完全培地を吸引しないアミノ酸が、最終的にオートファジー応答を阻害するDMEMから、残っていないことを確実にするために、飢餓培地2mlで3回洗浄する。設定ONタイマー。 </li></ol> 6。顕微鏡検査<ol><li>生細胞広視野落射用に構成されている適切なイメージング·システムが必要となる。これは、典型的には研究用倒立顕微鏡フレーム、蛍光タンパク質（単数または複数）/その他の染料（単数または複数）、高品質の対物レンズ、敏感なCCD / sCMOSに特異強烈な広域スペクトル光源、ミラーおよびフィルタを含む。カメラとインキュベーションチャンバー。 （すべての主要顕微鏡メーカーはライブセルイメージングに適した完全な広視野システムを提供していますが、それはメーカーの様々なコンポーネントを使用してシステムを家庭構築もすることが可能であり、そのようなマイクロマネージャーなどのオープンソースソフトウェアを使用してそれを制御<a href="http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/" target="_blank">します。http / / valelab.ucsf.edu /〜MM / MMwiki /</a> ）。我々の意見で最も重要な側面は、蛍光レポーターの発現レベルを最小限に抑えることができるように高感度のシステムを使用することである。 </li><li> SEL画像に適切なセルをecting。 <ol><li>もっとオートファゴソーム形成のイベントをキャプチャできるようになります大規模でフラットなセルを選択します。また、すでにomegasomesより多くの生産を開始した細胞を選ぶ。 </li><li>ビデオあたりオートファゴ形成事象のより大きな割合を捕捉するためには、30分後またはウェルファジー応答にビデオキャプチャを開始する。 </li></ol></li><li>イメージング。 <ol><li>高倍率レンズ（100×1.4 NA）を使用します。 </li><li>光退色を防止するために最大の10〜20％の励起光の強度を調整する。 </li><li> 100〜500ミリ秒の露出、2x2のビニングと100ゲインにカメラ（浜松ORCA ER、画素サイズ6.45μm）を設定します。 </li><li>画像取得速度1フレーム毎に10秒に設定します。 </li></ol></li></ol> 7。 ImageJのとオートファゴソーム形成イベントのモンタージュを作成する [これは、単に電子ためにマージされた映像をスキャンして非体系的な方法で行うことができる興味のある通気孔が、以下に概説するように、それはまた、体系化することができます。] <ol><li> ImageJの/フィジーの3（または2）キャプチャチャネルのためのオープン画像スタック。 </li><li>対応するチャンネルに、赤、緑、青のLUT（ルックアップテーブル）を適用し、3色をマージし、保存します。 </li><li>分析]タブから、[ツール]&gt; [ROIマネージャー]を選択します... &gt;指定し、スタックの最初の画像で定義されたサイズのランダムな領域を選択します。 </li><li> [イメージ]タブから、スタックの選択領域を複製するために、複製を選択します。 </li><li> [イメージ]タブで、[スタック]を選択&gt; [モンタージュを作る...キャプチャされたすべてのフレームを含む暫定的なモンタージュを作成します。完全なオートファゴソーム形成のイベントのモンタージュのすべてのフレームをスキャンし、イベントの最初と最後のフレームのノートを保つ。 </li><li>分析]タブから、[ツール]&gt; [ROIマネージャー]を選択します...他の2色のためだけでなく、マージされた色のイメージと重複してスタックのスタックの最初の画像で同じ領域を選択します。 </li><li> Tから彼はタブをファイル、[新規]&gt; [イメージ]を選択し、高さに設定されたROIマネージャを使用して最初に選択されたピクセルの数に応じた幅に設定されて4回ROIマネージャで設定した高さに加え、3色との間のスペースのために3ピクセル各スタック内のフレーム数として合併し、設定スライス。 </li><li> [イメージ]タブから、[スタック]&gt; [ツール]&gt; [挿入...、その後の間に1ピクセルのスペースを残して、別の上に各サブスタック1を挿入します。 </li><li> [イメージ]タブで、[スタック]を選択&gt; [モンタージュを作る...開始とキャプチャオートファゴソーム形成のイベントの最初と最後のフレームに仕上げモンタージュを作成します。 </li></ol>

<ol><li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+process+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li>
<li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li>
<li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+revisited%3A+a+conversation+with+Christian+de+Duve%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li>
<li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li>
<li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+%28%2A%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li>
<li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li>
<li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li>
<li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li>
<li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+autophagosomes%3A+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されていない。

このプロトコルに記載されている方法は、オートファゴソーム形成の間にタンパク質の局在を可視化することができます。我々は、ポイントスキャン共焦点、スピニングディスクを共焦点と全反射蛍光（TIRF）顕微鏡検査を含む説明イベントを可視化する様々な方法を試してみました。我々は、一般的な目的のために標準の広視野落射蛍光は感度と分解能との間の最良の妥協を提供することを見出した。これは、ノイズ、ミニマルphoto-bleaching/photo-toxicityと高速買収に良好な信号を保証します。セルの適切な領域はセルが広がって平らにされて周辺すなわちイメージに選ばれている場合は、光学セクショニングの欠如は問題ではありません。ただし、（使用するハードウェアおよびシステム設定の両面で）使用される撮像システムが適切に構成されていることが重要である。 最高の空間分解能のために、高倍率、Hを使用することが推奨されIGH開口油浸レンズ（水浸レンズはカバースリップに近接全く給付イメージングを提供しません）。これは、信号対雑音を最大化し、漂白最小限に抑えるための照度（中性濃度フィルタを使用<e...

自食作用は1-3オートファゴ形成の最終的な結果のために多数のタンパク質の調整を必要とする非常に動的なプロセスである。顕微鏡は、おそらく最も一般的にオートファジー4を研究するための適用手法です。最もファジータンパク質の局在化は、広く両方の内因性タンパク質を免疫染色することによって及び蛍光標識外因性タンパク質の発現により、固定細胞において研究されている。また、電子顕微鏡（EM）、単独および免疫金標識との組み合わせでは、これらの構造5,6の細部を説明した。時間-これらの技術は空間の3次元のオートファゴソーム形成の我々の理解を確立しているという事実にもかかわらず、彼らは4 番目の次元の情報の十分な量を提供するために失敗している。それはpossiとして近くにオートファゴソームの形成に続くことができるようにライブセルイメージングは​​この障壁を克服リアルタイム7〜BLE。この技術は、第吉森ら8によってファジーを研究するために用いられ、今後ますます使用されている。 タイムラプス顕微鏡は、生きた細胞内で、一定期間にわたってPOIの局在をキャプチャします。よく特徴付け自食作用および/または細胞小器官マーカーでこの情報を比較することにより、生細胞画像解析は、オートファゴ形成の大きな空間的および時間的文脈でPOIを置くことができる。固定された細胞のイメージングは​​、単一のキャプチャに基づいていながら、ライブセルイメージング解析は、オートファゴソーム形成のすべてのステップに沿ってPOI定位の繰り返し取り込みに基づいています。固定した細胞のイメージングが同時にlifecyの様々な段階で撮影多くのオートファゴソームにその平均ローカライズに基づいて、POIの役割のみを引き受けることができつつ、ライブセルイメージングは​​、オートファゴソーム形成の具体的なステップでPOIの貢献を証明することができますCLE。 ライブセルイメージングは​​、高パワーの分析方法であるが、考慮しなければならないいくつかの固有の限界を有している。まず、生細胞のイメージングは​​、1つ以上の外因性の蛍光標識タンパク質の発現を必要とする。蛍光タグのサイズは大きくなる傾向があり、彼らは、時には立体的理由のためにタンパク質の挙動を変更することができます。それらは膜の2次元の限られた空間で機能する必要があるとして、この状況は、膜タンパク質に対して強調されている。注目すべきは、オートファゴは膜構造であり、従ってそれらの形成は、膜結合タンパク質を大量に必要とする。 問題の別のセットは、POIの発現レベルに接続されている。原理的には、外因性タンパク質は、内因性タンパク質に匹敵するレベルで発現されるべきである。これは、そのサブ細胞内局在の重要な調節因子が飽和されないことを保証し、目電子分析は生物学的に関連するようになります。それらは、内因性レベル以上表される場合、それらはファジー応答9を阻害する傾向があるので、さらに、ファジータンパク質の過剰発現は、避けるべきである。 POIの発現レベルは、光退色なしに時間の良い期間の後に、そのローカライゼーションを可能にするのに十分高くなければならないので、逆に、妥協点に到達しなければならない。哺乳動物細胞における外因性タンパク質の最適な発現レベルを達成するには、微調整の多くを必要とするが、それは安定してPOIのさまざまなレベルを発現する細胞株を確立し、スクリーニングすることによって実現可能である。 標準的な蛍光顕微鏡を用いて達成することができる空間分解能は別の制限要因である。解像度はいくつかの理由のために制限することができるが、最高の状態で、横方向の分解能は250nmで前後になる。これは、これより小さい距離で区切られているオブジェクトが接続されている（または単一として表示されることを意味します250 nmのは、彼らが実際にあるより大きな画像で表現されますよりも小さな物体）とオブジェクト。したがって、画像は常に念頭に置いてこれを解釈されるべきで、そのようなEMなどの補完的な技術は細かい超構造の細部を解決する必要があります。 最後に、生細胞画像化は、本質的に長期間にわたって潜在的に、光に露出させるセルを必要とする。これは、セル、光毒性として知られる現象の生理学的応答を変化させることができる。 我々は正常にオートファゴソームがERストランド10,11と密接に関連しているPI3P豊富なリング状の構造と呼ばomegasomes、由来することを初めて記述するPI3P結合タンパク質DFCP1のライブセルイメージングを使用している。我々は明らかにLC3陽性構造はomegasomesと密接に関連して形成し始めることが示されている。ここ細胞株を用いた生細胞に対して安定GFP-DFCP1を発現することを示唆している目的のタンパク質のイメージングは​​、オートファゴソーム形成におけるその役割の特性評価のための堅牢な空間および時間枠を確立します。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41965</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red FM</td><td>Invitrogen</td><td>M22425</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td><td>Roche Applied Science</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>22 mm coverslips</td><td>VWR</td><td>631-0159</td><td></td></tr><tr><td>35mmプレート</td><td>フィッシャーNUNC</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>シリコングリース</td><td>RSコンポーネンツ(株)</td><td>RS 494-124</td><td></td></tr><tr><td>Oリング</td><td></td><td></td><td>カスタムメイド</td></tr><tr><td>Attofluor Cell Chamber</td><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td>カスタムメイドのOリングに代わるものを推奨</td></tr><tr><td></td><td>顕微鏡 オリンパス</td><td>IX81</td><td>倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>対物</td>レンズ <td>オリンパス</td><td>UPLSAPO 100XO</td><td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td></tr><tr><td>カメラ</td><td>浜松</td><td>ORCA-R2 C1060010B</td><td>プログレッシブスキャンインターライン CCD</td></tr><tr><td>イルミネーター</td><td>TILL フォトニクス</td><td>ポリクロームV</td><td>超高速モノクロメーター</td></tr><tr><td>インキュベーションチャンバー</td><td>ソレント サイエンティフィック</td><td>セル^R IX81</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td>オリンパス</td><td>SIS xcellence</td><td></td></tr></tbody></table>

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブomegasomesを以降

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

自食作用は、特に栄養素の不足、アミノ酸の欠如によって引き起こされる細胞応答である。自食作用は細胞質、長寿命のタンパク質およびタンパク質凝集体であっても、欠陥のある細胞小器官、およびウイルスまたは細菌を隔離ファゴソームと呼ばれる二重膜構造の形成、によって定義される。オートファゴソームは、最終的に細胞質に戻ってリサイクルされる生産の栄養素と、そのコンテンツのバルク劣化につながるリソソームと融合。そのため、オートファジーは、細胞の恒常性のために重要であり、オートファジーの調節不全は、疾患、特に神経変性、老化やがんにつながることができます。 オートファゴソームの形成は、細胞がコアオートファジー機械と呼ばれる、タンパク質の特定のグループを割り当てているため、非常に手の込んだプロセスです。コアオートファジー機械は機能MEMBRANで例えば 、多様な細胞プロセスに関与する付加的なタンパク質によって補完されミトコンドリアとリソソーム生物学におけるe密売、。オートファゴソームの形成と分解のためのこれらのタンパク質の調整はオートファジーの非常にダイナミックで洗練された応答を構成している。ライブセルイメージングは​​1つが、単一のオートファゴソーム形成のイベントのレベルまで各オートファジー関連タンパク質の分子の寄与を下に従うことができ、リアルタイムで、そのためこの手法は、高い時間·空間分解能を提供しています。 ここでは、我々の分析のための空間的および時間的なコンテキストを確立するために、安定的にGFP-DFCP1を発現する細胞ラインを使用。オートファゴソームの形成につながる前駆構造ですDFCP1マークomegasomes、。目的のタンパク質（POI）は、赤やシアン蛍光タグのいずれかをマークすることができます。ミトコンドリアとリソソームERのような別の細胞小器官は、、、すべてのオートファゴソーム形成の異なるステップに関与しており、特定のトラッカーの染料を使用してマークすることができます。 AUTOPのタイムラプス顕微鏡この実験的なセットでhagyアップ、情報が四次元、 すなわち時間について抽出することができます。したがって、我々は時間と空間にオートファジーにPOIの寄与に従うことができます。

プロトコルは説明では、安定的にオートファジーを誘導する条件下では、GFPタグDFCP1を発現している細胞株におけるCFP-タグLC3の局在に従うことをタイムラプス顕微鏡を使用している。この実験の結果は、2シリーズまたはGFP-DFCP1とCFP-LC3に対応する画像、緑色から1と青のチャンネルから1つのスタックのキャプチャです。我々はさらに、プロトコルのセクションで説明したように、単一のオートファゴ形成イベントに対応するモンタージュを作成するために、ImageJのを使用してこれらのビデオを分析した。この分析は、私たちがLC3陽性のオートファゴソームがDFCP1陽性omegasome由来することを証明することができました。 図2に示すモンタージュにおいて、omegasomeの形成は小さなスポットの形で、第二フレームから明らかになる。 omegasomeは、特性リング状の構造を形成するために膨張を開始し、6分後に最大直径に達する。次に、omegasomeは、Cを開始ollapsing、結局それが消え、約10分後。今omegasome形成の文脈におけるLC3陽性構造やオートファゴソームの形成を入れて、私たちは...

蛍光標識したオートファジーマーカーのタイムラプス顕微鏡は、高時間分解能とダイナミックオートファジー応答の監視ができます。 3つの異なる色の組み合わせで特定のオートファジーとオルガネラのマーカーを使用して、我々は強固な空間的·時間的文脈におけるオートファゴソーム形成にタンパク質の寄与に従うことができます。

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

この手順の全体的な目標は、ミクロソームおよびリソソームと組み合わせたlc 3つの正のオートファゴソームの形成を捕捉することです。これは、オメガゾーンのGFPD FCP one Aマーカーを安定して発現するHEC 2 9 3 T細胞を使用し、それらをCcfp lc three oneでトランセクトし、リソソームを赤色凍結トラッカーでマーキングすることによって達成されます。2番目のステップは、インキュベーションチャンバーを準備することです。次に、インキュベーションチャンバーを顕微鏡ステージに置き、リッチ培地を飢餓培地に置き換えてオートファジー応答を誘導します。最後のステップは、適切なセルを選択し、ビデオ顕微鏡のパラメータを設定することです。最終的に、ライブセルイメージングを使用して、lc 3 陽性ファゴソームが DFCP 1 陽性オメガゾーンに由来し、最終的にリソソームと融合することを示します。この手法が固定細胞イメージングなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、同じ細胞内のイベントの進行を経時的に注意深く監視できることです。この方法は、フォーカス形成につながるイベントの原因など、PHAの失敗における重要な質問に答えるのに役立ちます。この研究では、生細胞イメージングの48時間前にオートファゴソーム形成につながる前駆体構造であるオメガゾーンのGFPD FCP one Aマーカーを安定して発現するHEC 2 9 3 T細胞株を利用しています。DMEM培養で22ミリメートルの丸いカバースリップの細胞の低継代数を、摂氏37度で5%の二酸化炭素で一晩、翌日に30〜40%の同時流暢さで見てください。最適な 1 つの減量血清中極端 G nine DNA、トランスフェクション試薬、および P-E-C-F-P lc 3 つの血漿 DNA lc を含む各プレートのトランスフェクションコンプレックスミックスを調製しました。3つ目は、この実験でオートファゴソーム形成への寄与を解析する目的タンパク質で、ピペッティングで上下させて穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートします。次に、細胞のプレートから培地を吸引し、摂氏37度に予温した新鮮なDMEMを加えます。トランスフェクション複合体を細胞に加え、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。24時間後、細胞は80%コンフルエントになり、オルガネラマーカーを使用する場合、ライブセルイメージングの準備が整います。実験では、以前に調製したミトトラッカーまたはミディアム入りのリヨトラッカーの2ミリリットルのアリコートを取り出し、摂氏37度に温めます。この実験では、トランスフェクションされた細胞からリソソーム吸引培地をマークするために、red lyo トラッカーを使用します。培地が入ったlyoトラッカーと交換し、細胞を30〜60分間インキュベートします。この手順を開始するには、75%エタノールで金属とプラスチックのOリングを洗浄し、金属Oリングの縁にシリコーングリースを塗布します。鉗子を使用して、プレートからカバースリップを取り外し、カバースリップの下側から余分な媒体を乾燥させます。これは、グリースに媒体を混ぜすぎ、漏れの可能性を高めるのを避けるためです。カバースリップをプラスチックOリングの棚に載せたままにし、カバースリップを挟んでプラスチックOリングの上に金属製Oリングを取り付けます。密閉チャンバーを作成するには、プレートから培地をチャンバーに補充します この時点から、pHの変化を防ぐために緩衝剤なしでDMEA培地に細胞を長時間インキュベートすることは避けてください。次に、インキュベーションチャンバーを顕微鏡ステージに置き、細胞を飢餓状態にしてオートファジー応答を誘導します。完全な培地を吸引し、2ミリリットルの飢餓培地で2回洗浄します。2回目の洗浄後、2ミリリットルの新鮮な飢餓培地を追加し、この実験に必要な生細胞広視野エピ蛍光用に構成された適切なイメージングシステムにタイマーを設定します。このシステムは通常、研究グレードの倒立顕微鏡フレーム、目的の蛍光タンパク質または色素に特化した高強度広域スペクトル光源ミラーとフィルター、高品質の対物レンズ、高感度C-C-D-S-C-M-O-Sカメラ、およびインキュベーションチャンバーで構成されます。最も重要な要素は、蛍光レポーターの発現レベルを最小限に抑えるために、高感度のシステムを使用することで、大きくて平らな細胞をイメージングするための適切な細胞を選択することで、より多くのオートファゴソーム形成イベントを捕捉できるようにすることです。さらに、すでにより多くのオメガゾーンを生成し始めている細胞を選択します。光退色防止のため高倍率レンズを使用し、励起光の強度を最大10〜20%に調整してください。カメラを100〜500ミリ秒の露出に設定し、2×2回転して100ゲインにします。画像取得速度を 10 秒ごとに 1 フレームに設定します。ビデオ1回のオートファゴソーム形成イベントの比率を大きくするために、オートファジー応答の30分後または十分に開始してからビデオキャプチャを開始します。本研究では、G-F-P-D-F-C-P oneとCCF PLC 3を発現する細胞を30分間飢餓状態にし、その後10秒ごとに1フレームの割合でイメージングしました。このビデオは、オートファゴソーム形成イベントの様子です。再生レートは毎秒4フレームです。ビデオで捉えられた代表的なオートファゴソーム形成イベントのモンタージュをこの図に示します。緑色チャネルからの信号はDFCP1を擬似色緑、青チャネルからLC3を示す信号は擬似色赤です。オメガゾーンの形成は、矢印で示された小さなスポットの形で2番目のフレームから明らかになります。オメガゾーンは、特徴的なリング状の構造を形成するために膨張し始め、約6分後に最大直径に達します。次に、オメガゾーンは崩壊し始め、約10分後には消失します。lc 3の正の構造またはオートファゴソームの形成をオメガゾーン形成の文脈に置くと、オートファゴソームがオメガゾーンの後に現れ、はっきりと見えるようになることが観察されました。約1分半後、オートファゴソームはオメガゾーンのスポットと密接に関連して拡大し始め、オメガゾーンが崩壊し始めると鳴り響き、オートファゴソームは芽を出します。最終的に、オートファゴソームは、オメガゾーンが消えた後もリソソームと融合するために残っています。この次のビデオでは、形成中のオートファゴソームの時間的および空間的な関連性を捉えるために、青色で示されたリソソームトラッカーが追加されました。リソソームの場合、再生速度は毎秒4フレームです。矢印は、最初にオメガゾーンの形成を示し、次にオートファゴソームとリソソームの融合を示します。この図は、矢印で示されているように、ビデオにキャプチャされたイベントのモンタージュです。オメガゾーンの崩壊から数分後、新生オートファゴソームはリソソームと会合し始め、最終的にはオートファゴソームとリソソームの融合体と融合し、おそらくCFPタグがリソソームの酸性環境にさらされるため、CFPL C3蛍光を大部分消光します。ただし、同じ種類の分析でも、さまざまな理由により解釈できない結果が生じる場合があります。この例では、フォーカスのドリフトにより、結果は解釈できなくなります。画像を解析すると、オートファゴソームの形成は、最初にビデオによってうまく捉えられていることがわかります。ただし、3分を過ぎるとピントがずれます。ビデオキャプチャは次の6分間ピントが合わないままですが、最終的には9分から10分後に手動でピントが修正されます。残念ながら、この解析では、ピントを補正したときに捉えられたオートファゴソーム形成イベントが、ほぼ完了した最初のイベントなのか、それともフォーカスのドリフト後に始まった新しいイベントなのかを区別することは不可能です。ピントのずれを防ぐために、ビデオを常に監視し、必要に応じて手動で、または可能な場合は顕微鏡のオートフォーカス機能を使用して修正を行う必要があります。一度マスターすると、このテクニックは、適切に実行されれば、映画のビデオごとに1時間以内に行うことができます。このビデオを見れば、ミクロソームやリソソームによるオートファゴソームの形成追跡など、ライブセルイメージングアプリケーション用の顕微鏡のセットアップ方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

劣化とリサイクルのための酵母の液胞の酸性内腔に細胞小器官の配信を監視するための堅牢なアプローチが説明されています。方法は、遺伝的に符号化されたデュアルエミッション蛍光のpHバイオセンサー、及び蛍光顕微鏡を使用して、個々の細胞の可視化とターゲットの細胞小器官の特定のラベルに依存しています。...

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

このビデオでは、前立腺がん細胞におけるアルギニンデイミナーゼに基づくオートファジー誘導を実演しています。さらに、高度な蛍光顕微鏡を使用して、オートファゴソームとリソソームの形成と分布、およびそれらのオートリソソームへの融合など、オートファジー誘導に関連する変化を視覚化できます。...

ADIによる前立腺がん細胞のオートファジー誘導:酵素を用いた細胞のオートファジー応答測定技術

オートファジーは、細胞がタンパク質や細胞小器官が低下し、リサイクルを可能にするユビキタスプロセスです。我々はautolysosomesに小さいが、オートファゴソームとリソソームの形成と流通を含むオートファジーの誘導に関連付けられている本質的な、物理的な変化、およびそれらの融合を可視化し、定量化するための高度な蛍光顕微鏡を適用します。...

高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

ここでは、LC3スポット計数とともに、3つのオートファジーマーカーの明るい詳細画像を比較し、それらの共局在化を定量化する分析的特徴を有するマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いて、客観的、定量的および統計的に堅牢な方法でオートファジーを測定した。...

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Mitophagy、クリア破損しているミトコンドリアのプロセスはミトコンドリアの恒常性と健康維持のため必要です。この記事は最新の mitophagy...

In VitroとIn Vivo検出、ひと細胞、線虫、マウス Mitophagy の

このプロトコルの目的は、LC3免疫蛍光およびLC3ドット定量を通じて、膵臓癌および膵臓腺房細胞のオートファジーレベルを決定することです。...

LC3免疫蛍光を用いた2つの異なる膵臓細胞モデルにおけるオートファジーレベルの評価(英語)

ここでは、細胞の超微細構造に関連する希少タンパク質の局在を調査するためのツールとして、内因性蛍光標識に基づく最適化されたオンセクション相関光電子顕微鏡法のプロトコルを紹介します。このアプローチの威力は、バフィロマイシン処理を行わない飢餓細胞における内因性LC3の超微細構造局在によって実証されています。...

オンセクション相関光電子顕微鏡による内因性LC3の超微細構造局在

脂肪食は、脂肪滴の分解を伴うオートファジーの選択的な形態です。このプロセスの機能不全は、がんの発症に関連しています。しかし、その正確なメカニズムはまだ完全には解明されていません。このプロトコルでは、オートファジー、脂質代謝、およびがんの進行の相互作用をよりよく理解するための定量的イメージングアプローチについて説明します。...

脂肪食法による脂質飛沫異化作用の制御の探索

このプロトコルは、リソソーム膜の完全性と酸性化の変化を検出する蛍光プローブを利用して、ネクロプトーシス中のリソソーム膜透過性をモニタリングするための生細胞イメージング法を説明しています。...

ネクロプトーシス中のリソソーム膜透過処理の生細胞イメージング

学ぶライブセルイメージングによるオートファジー動態解析。HEK293T細胞を用いてGFP-DFCP1とCFP-LC3マーカーでオメガゾーンからオートファゴソーム形成をリアルタイム観察し、リソソームとの融合過程を解明する方法です。

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

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