Name: 3Dで浸潤癌細胞の細胞骨格組織を明らかにする (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-26T21:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 学ぶ 3Dコラーゲン基質中の浸潤癌細胞の細胞骨格組織の可視化法。ラット尾コラーゲンを蛍光標識し、共焦点顕微鏡で深部Zスタックを取得することで、細胞形態とタンパク質局在を解析します。

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作者は感謝した画像は、 図3とPICT-IBISAイメージング機能（研究所キュリー）で取得して処理するために博士ワシーリーGurchenkov（キュリー研究所）を認める。 in vitroで細胞のモデルでコンプレックス-この仕事はANR-09-JCJC0023-01、ARC SFI20111203863とPIC 3Dによってサポートされていました。

1。 TAMRA-コラーゲンIラベル<ol><li>供給25mgのTAMRA粉末に2.5ミリリットルのDMSOを加えることにより10 mg / mlのTAMRA溶液を調製。完全に溶解するまでボルテックスすることにより、それを溶かす。 -20ºCで保存し、光から保護します。 </li><li>標識バッファー（0.25 M NaHCO 3を 、0.4 M NaCl）を2Lのを準備します。 10 MのNaOH溶液を用いてpHを9.5に調整する。 4℃に保つ特に明記しない蛍光体は、アルミニウム箔を用いて光から保護されていない限り、この時点から、すべての操作は4℃で実施される。 </li><li>高度に濃縮されたラット尾コラーゲンI溶液1mlで1ミリリットル使い捨て注射器を埋める。高濃度のコラーゲン溶液は、典型的には10 mg / mlの濃度の周りに設けられており、非常に粘稠であるて​​いる。気泡の形成を避けるためにゆっくりとそれを操作してください。 </li><li> 21 Gの皮下注射針を使用し、MWCOカットオフ10,000予浸3ミリリットル透析カセットにコラーゲンを注入する。玉を避けるために注意してください針で膜パトン。シリンジピストンを引き上げて透析カセットからすべての空気を除去する。ラベルバッファの1リットルに対して一晩、それを透析。 </li><li>ラベルバッファの900μlの10 mg / mlのTAMRA溶液100μlを混ぜる。注：DMSOは4℃で凍るので、これは、室温でTAMRAソリューションとラベルバッファの両方で行う必要があります混合した後、4℃に希釈TAMRAソリューションを持ち帰る</li><li>慎重に21 Gの皮下注射針で2ミリリットル使い捨て注射器を使用して透析カセットからコラーゲンを削除します。ピペッティングにより希釈TAMRA溶液1mlで透析コラーゲン溶液1mlを混ぜる。 </li><li> 2 mlのマイクロ遠心チューブにコラーゲン/ TAMRAミックスを移し、回転で一晩インキュベートする。 </li><li>予浸3ミリリットル透析カセットにTAMRA標識コラーゲン2 mlを移し、自由色素の過剰を削除するには、バッファのラベリングの1 Lに対して一晩透析。 </li><li> TAMRA-ラボを復元するには元のコラーゲン溶液にELEDコラーゲンは、0.2％のL 1（v / v）の酢酸溶液、pHが4の中に透析カセットを配置し、一晩透析する。 </li><li> TAMRA標識コラーゲンの最終容積を測定し、使用されるコラーゲン溶液の初期体積と濃度を考慮して、最終的な濃度を計算。 4℃で保存</li></ol> 2。組込シングルセルで3D TAMRA-コラーゲンマトリックス<ol><li>実験のために必要な2 mg / mlのTAMRAコラーゲンミックスの体積を計算する。常にコラーゲン高粘度に起因する損失をピペッティングを考慮して20％以上を準備します。 </li><li> 10倍のPBSと1NのNaOHのストック溶液を調製。 4ºCでフィルター滅菌し、維持特に明記しない限り、無菌条件下で、この時点から、すべての操作を氷上で行われる。 </li><li>希望のコラーゲン濃度およびpH 7.4を達成するために適切な容量で10倍PBSと1NのNaOHを混ぜる。例えば、1 mlの最終容積のためにpH7.4でTAMRAコラーゲンミックスの、1N NaOHを5μlの10倍のPBSを100μlを兼ね備えています。よく混ぜる。 </li><li> TAMRA標識コラーゲン及び2 mg / mlの最終的な総コラーゲン濃度を達成するための1時06分比で標識されていないコラーゲン両方の適切なボリュームを追加します。例えば、2 mg / mlのTAMRAコラーゲンミックス1mlの最終容量のために、3.68 mg / mlのTAMRA標識コラーゲンと未標識コラーゲンの4.01 mg / mlのの415.71μlに90.48μLを加える。気泡の形成を回避し、ピペットでよく、ゆっくりと混合する。 </li><li> 10 5細胞/ mlおよび2 mg / mlのコラーゲンの最終濃度の最終細胞密度を得るために、TAMRA-コラーゲンの組合せにすることなく冷却されたFBS細胞培地の適切なボリュームに懸濁した細胞を加える。例えば、2 mg / mlのTAMRAコラーゲンミックス1mlのために、10 5個の細胞を含むメディアの388.81μLを加える。気泡の形成を回避し、ピペットでよく、ゆっくりと混合する。 pH試験の上でミックスを10μLをテストすることによって、pHを確認旅。 </li><li>ガラスボトムディッシュにTAMRAコラーゲンミックスのピペット100μlの滴と、それは30-45分間室温で重合することができます。 100μlのコラーゲン滴を7mm典型的な直径を有し、高さ2mmである。重合すると、コラーゲンは白色っぽいゲルに変わります。注意：コラーゲンはお皿を閉じずに重合することができるようにすると、ガラスからの剥離を低減し、コラーゲンの低下を中心水膜の形成を避けることができます。密着性を高めるために、ガラス皿を100μgの/ mlでポリ-L-リジンで被覆することができる。 </li><li>慎重にコラーゲン/セル滴をカバーするために十分な培地を追加します。コラーゲンドロップが簡単に取り外すことができるので、メディアや急激な動きの高いフラックスを避けてください。細胞がマトリックスに移行するための十分な時間（通常1-3日）を10％CO 2の加湿空気中で37℃で保管してください。 </li></ol> 3。組み込み細胞スフェロイドの3D TAMRA-コラーゲンマトリックス<ol><li> 2 mg / mlのTAMRAコラーゲンMの体積を計算実験のために必要なIX。常にコラーゲン高粘度に起因する損失をピペッティングを考慮して20％以上を準備します。 </li><li> 10倍のPBSと1NのNaOHのストック溶液を調製。 4ºCでフィルター滅菌し、維持特に明記しない限り、無菌条件下で、この時点から、すべての操作を氷上で行われる。 </li><li>希望のコラーゲン濃度およびpH 7.4を達成するために適切なボリュームにFBSことなく10倍PBS、1 N NaOHおよび細胞培地を混ぜる。例えば、pH7.4でTAMRAコラーゲンミックス1mlの最終容量のために、10倍のPBS100μlを、1NのNaOH5μlのメディアの388.81μLを兼ね備えています。よく混ぜる。 </li><li> TAMRA標識コラーゲン及び2 mg / mlの最終的な総コラーゲン濃度を達成するための1時06分比で標識されていないコラーゲン両方の適切なボリュームを追加します。例えば、2 mg / mlのTAMRAコラーゲンミックス1mlの最終容量のために、3.68 mg / mlのTAMRA標識コラーゲンの90.48μlのとunlaの4.01 mg / mlのの415.71μLを追加beledコラーゲン。気泡の形成を回避し、ピペットでよく、ゆっくりと混合する。 pH試験ストリップ上のミックス10μLをテストすることによって、pHを確認してください。 </li><li>ガラスボトムディッシュにTAMRAコラーゲンミックスのピペット100μlの滴と、それは2-5分間重合を開始することができます。これは、若干のゲル粘度を増加させることによりスフェロイドの沈み込みを防止するのに役立ちます。 100μlのコラーゲン滴を7mm典型的な直径を有し、高さ2mmである。 </li><li>細胞スフェロイドを収集し、クリーンなペトリ皿の上に置きます。液体の余分を削除し、TAMRAコラーゲンミックス10μlにそれを再懸濁します。これは、セルメディアとコラーゲンの希釈を防止することが重要である。 </li><li> P20ピペットを用いて、コラーゲンは回転楕円体濁し、100μlのTAMRAコラーゲンミックスドロップの中央上部に置きます集める。注：彼らが侵入し、及び/又は移行する各他の容量に影響を与えることができるので、コラーゲンの低下ごとに複数の回転楕円体を置かないでください。 </li><li>ポリにTAMRAコラーゲンミックスを許可する30-45分間室温でmerize。重合すると、コラーゲンは白色っぽいゲルに変わります。注意：コラーゲンはお皿を閉じずに重合することができるようにすると、ガラスからの剥離を低減し、コラーゲンの低下を中心水膜の形成を避けることができます。密着性を高めるために、ガラス皿を100μgの/ mlでポリ-L-リジンで被覆することができる。 </li><li>慎重にコラーゲン/スフェロイド滴をカバーするのに十分な培地を追加します。コラーゲンドロップが簡単に取り外すことができるので、メディアや急激な動きの高いフラックスを避けてください。 </li><li>細胞がマトリックスに侵入する/移行するための十分な時間（通常1-3日）のために、10％のCO 2加湿空気中で37℃で保管してください。 </li></ol> 4。 3D免疫蛍光染色<ol><li>慎重に細胞培地を除去し、PBSで細胞/スフェロイドを含むコラーゲンマトリックスをすすいでください。 </li><li>同時に抽出/固定液（4％PFA、0.3％トリトンX-100、PBの5％ショ糖でインキュベートすることによって固定し、細胞を抽出5分間S）。 2μMのファロイジンと細胞骨格や細胞骨格関連タンパク質の可視化のためのタキソール2μMでバッファを補う。 </li><li>さらに、4％PFAで30分間、PBS中の5％スクロースで細胞を固定します。 0.05％PBS中のTween-20で洗い流してください。 </li><li> PBS中で一次抗体溶液を調製。室温または一晩4℃で少なくとも1時間一次抗体で細胞をインキュベート全体のコラーゲンの低下をカバーするのに十分な解決策を追加してください。 35ミリガラスボトムディッシュのために、溶液1.5〜2溶液に必要であろう。注：抗体溶液の量を減らすために、例えばシリコーングリース又はPDMSリングの円周線と水不溶性障壁は、コラーゲン滴の周りに配置することができる。 </li><li> 0.05％PBS中のTween-20で3回、30分間洗浄します。 </li><li>アレクサ標識二次抗体を、PBS中アレクサ共役ファロイジン及びDAPI溶液を調製する。室温で2時間、適切な二次抗体で細胞をインキュベートする。 </li><li> 3X 3を洗うのTween-20、PBS中の0.05％と0分。 </li><li>液体の過剰を取り除き、ガラスボトムディッシュ底（約500μL）を記入し、密封するために上部に24ミリメートルのカバースリップを置くために十分なマウントメディアを追加。コラーゲンの低下を圧縮し、3Dの組織の損傷を防ぐために、カバースリップを下に押さないでください。 </li></ol> 5。サンプルイメージングクラシックまたは回転するディスク共焦点顕微鏡を使用することができます。反転されたシステムは、優先的にガラス下から撮像された細胞の距離を決定するために使用されるべきである。この作業のために使用されるシステムは40X/1.3NAと60X/1.4NA油浸対物レンズ（それぞれ距離は200μmと130μmのを、作業）、Photometrics CoolSNAP HQ2カメラ、1392 X 1040を搭載した倒立共焦点スピニングディスクですイメージング·アレイ、6.45 X 6.45μmのピクセルと変形者イメージングソフトウェアによって制御されます。 405nmで、491 nmで、561 nmであり、かつ633nmのレーザは、典型的には30〜50％のパワーで使用される、利得1および2のビニング露光時間を短縮すること×2。 、FITC（EXC 478から495;全角510から555）と、テキサスレッド（EXC 560から580;全角600;顕微鏡もDAPI（全角450から465 EXC 400から418 nm）のための水銀ランプとフィルターキューブが装備されている-650）アイピースで使用する。 <ol><li>蛍光灯を使用した、コラーゲンの低下の中央に40X客観的に配置します。のx-y軸およびz軸の両方において、試料の概要を取得する。エッジ効果を避けるために、画像を取得する際のxy軸のゲル端から100μm以上を逸脱しないことを確認してください。ときイメージングスフェロイド、彼らが客観作動距離の下にあることを確認してください。必要に応じて目標を変更してください。 </li><li>共焦点ライブイメージングモードに切り替えます。 TAMRA標識したコラーゲンを可視化するために561 nmのレーザーを使用することにより、ガラスの底部から出発すると、コラーゲン繊維が現れ始めるれるzの値を決定する。これにより、基板底面およびz = 0である。 </li><li>フォーカスノブを使用して、Z = 0から100程度まで行く。 Z = 100ミクロンでセルのみ以上硬質ガラス底から張力の影響を回避するために結像されるべきである。 </li><li>イメージにセルを選択します。波長毎にカメラの露出時間とレーザパワーを最適化する。 DAPIおよびアレクサ488ファロイジンの典型的な露光時間は100〜200ミリ秒の間である。抗体染色のための露光時間は変わる場合があります。 </li><li>フォーカスノブを使用して染色し、ファロイジンを可視化するための適切なレーザを用いた共焦点ライブモードでは、電流を上部と下部のzの値を設定することにより、zの系列間隔を定義する。 </li><li> zのステップサイズを定義します。 40Xの目的のために、1ミクロンを使用しています。 60Xの場合、0.5μmのを使用しています。取得を開始します。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

私はTAMRAを使用蛍光ラベルコラーゲンにここで説明するプロトコルは、561 nmのレーザーを搭載した標準的な共焦点顕微鏡を使用することにより、コラーゲンネットワーク組織を簡単に可視化を可能にする優れた方法を提供します。反射率共焦点顕微鏡と比較して、この技術の利点は、三次元マトリックスに深く画像コラーゲン繊維の能力である。繊維反射の強度およびコントラストは、レーザ光の吸収および散乱に起因する深さの実質的に減少する。反射率共焦点顕微鏡を使用した場合、撮像面から50度のまわりに整列した繊維が完全に検出されないこともあるので、コラーゲン繊維の配向は、主要なハンディキャップとすることができる。蛍光標識された繊維は、それらの方向20の独立した類似の明るさを検出する。 インビトロおよびインビボの両方でますますコラーゲン束を可視化するために使用されている別の方法は、第2高調波発電機によるものであるeration（SHG）。このプロセスは、コラーゲン21と非中心対称構造による信号をSHGの放出に基づいている。しかし、SHGは、標準的なラボのイメージング機器...

細胞移動の分野では、ブランドの新しい三次元の世界に勇敢に立ち向かうされています。これは、最も近い3次元（3D）、したがって、生理1に似ており、環境内の細胞遊走を研究する直感的である。しかし、技術的な制限により、ほとんどの細胞遊走試験は、未処理又は適切な細胞外マトリックス（ECM）タンパク質で被覆されたいずれかの剛体二次元（2D）基板を横切って細胞運動を解析することが行われている。 三次元コラーゲン格子において細胞遊走に捧げ最初の研究は20年以上戻って1-3行く。ただし、過去5年間では遊走細胞が実質的にその形態や基板の次元に応じて、移行のモードで異なる可能性があることが明らかになった。 2Dで、細胞が広いだけで平坦突起の形成（葉状）、その結果、接着斑を使用して、腹面を有する基板に連絡彼らのリーディングエッジに埋め込まれた指状の突起（糸状仮足）。これらの構造体は、一緒に後縁へのセル前面を接続するストレスファイバーと、2Dで細胞運動のために重要であると考えられている。 3Dマトリックス中に、細胞が形成し、これらの構造の多くの機能的関連性にかなりの変化を引き起こし、ECMを接触全体細胞表面と、一般的に細長いある。逆に、他の細胞の機能は、このようなECMリモデリング4に関わる核変形や構造などの3D移行に関連性を得ることができます。 これらの既知の形態学的変化、ならびにECMおよび細胞型に応じて変化し得る5-7移行モードの違いは、3Dマトリックス内に埋め込 ​​まれた細胞の構造的および機能的な解析にもかかわらず、依然として異常なままである。太く密3D行列の操作技術などの高解像度の顕微鏡イメージングなど困難、最も安定して非互換性を運ぶndardプロトコルは、内因性タンパク質の免疫蛍光ラベルのように、2次元文化のために最適化されています。 3Dマトリックスの使用は比較的新しいアプローチであるため、また、研究者は依然として密接な異なる組織器官の正常な間質アーキテクチャまたは腫瘍の周囲のECM組織として生体内の状況で特定の似ているように最高の条件を調査している。異なるグループに関する検索結果の矛盾は、例えば、癌細胞の遊走のモードや接着斑の存在は、いくつかの論争8を生成した。多くの努力が最近ECM化学的性質、細孔径、繊維の太さ、およびマトリックス剛性の点で合意に達するために専念してきました。 3D ECMは多くの異なるタイプの現在市販されているマトリゲルに細胞由来のマトリックスを変化させ、使用されている、pepsinizedウシコラーゲンI、またはnonpepsinizedラット尾部コラーゲンI.は、これらの行列の各々は、特定の物理的および化学的性質を有し、相対する1つのニーズ検討されて生理的プロセスに最適なTEが行列。また、細孔径および繊維の厚さは、例えばpH及び温度9,10等の重合条件に依存することができる。にとガラスのようなリジッド基板からの距離バインド、またマトリックス10,11の弾性特性を変更することができます。 この記事では、単一の細胞またはスフェロイドとして、3Dがん細胞培養の準備及びイメージングのための方法が記載されている。癌細胞スフェロイドの製造方法は、以前に、ハンギングドロップ法12,13およびアガロースでコーティングされたプレート法14、最も人気のあるものに記載されている。癌細胞の移動に適したECMの基板として、Iは室温で重合nonpepsinizedラット尾コラーゲンは2 mg / mlのに使用される。 Nonpepsinized酸抽出したコラーゲンラット尾から私は両方のN-およびC-末端テロペプチド、天然コラーゲンintermolecの責任コラーゲン分子のnonhelical部分を保持ウラル架橋とfibrilar安定性15。併せて、これらの条件に最も近いインビボ 10 で観察されたものに似たコラーゲンネットワークの形成を可能にする。詳細なプロトコルは、蛍光5を用いたin vitro 10 中のコラーゲンを標識するために設けられている固定および培養物中で生きている、コラーゲン繊維の視覚化を可能にする- （および-6） -カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、スクシンイミジルエステル。このプロトコルはBaici らから適応されています。フルオレセインイソチオシアネートは、水溶性のコラーゲン分子を標識するために使用されている16,17。フルオレセインとして、TAMRAは、例えば、N末端の遊離アミノ基と、より重要なのは、リシンの側アミノ基のようなタンパク質のnonprotonated脂肪族アミノ基と反応するアミノ反応性蛍光色素である。リジンアミノ基がnonprotonated形態である場合、この反応は、塩基性のpHで起こる。 TAMRAに加えて上のフルオレセインよりも安定している時間は、その発光スペクトルは便利GFPタグ融合タンパク質の生細胞イメージングのために組み合わせることができ、赤/オレンジレンジ（EX / EM = 518分の555 nm）で、上に落ちる。アミノ反応性色素でラベルされた可溶性コラーゲン分子を使用すると、重合プロセスでも密度、細孔径とコラーゲンマトリックス10,16,18,19の架橋状態には影響を与えません。 このプロトコルは、さらに細胞骨格や細胞骨格に関連するタンパク質を標識するために最適化された内因性タンパク質の三次元免疫ラベリングするための方法も含まれています。このプロトコルの最終的な焦点は、コラーゲンマトリックスの張力に硬質ガラス製カバースリップの低減に寄与共焦点顕微鏡を用いた3次元培養物の高解像度の画像を取得する方法である。

<table><tbody><tr><td>TAMRA, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C-1171</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ラットテールコラーゲン高濃度</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>354249</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ラットテールコラーゲン</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>354236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ファロイディン</td><td>シグマ</td><td>P2141</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>タキソール(パキシテル)</td><td>シグマ</td><td>T7402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>マウス抗αチューブリン抗体</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa 488 ファロイジン</td><td>インビトゲン</td><td>A12379</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa 633 ヤギ抗マウス抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A21052</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>インビトロジェン</td><td>D1306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>封入剤</td><td>Fisher Scientific</td><td>106 226 89</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>透析カセット</td><td>ピアス</td><td>66380</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>ワールド精密機器</td><td>FD35-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MetaMorph顕微鏡の自動化&画像解析ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Imaris 7.2.3</td><td>ビットプレーン</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

3dで浸潤癌細胞の細胞骨格組織を明らかにする

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

細胞遊走は、伝統的に、2D基板で研究されている。しかし、それは、問題の生理学的プロセスの次元に似て良い、より適切な3D環境での細胞遊走を研究する必要があることがますます明らかになっている。遊走細胞は、実質的に、彼らは2Dまたは3Dの基板上に移動しているかに応じてその形態と移行のモードで異なる場合があります。 3Dマトリックス内に埋め込まれた細胞のほとんどは標準プロトコル、構造及び機能解析と技術的な問題と互換性がないため、まだ珍しい​​のまま。この記事では、単一の細胞またはスフェロイドとして、3Dがん細胞培養の準備及びイメージングのための方法が記載されている。癌細胞の移行のための適切なECM​​基板として、我々は、私は室温で重合し、蛍光共焦点顕微鏡の標準を使用して可視化を容易にするためのラベルnonpepsinizedラット尾コラーゲンを使用しています。この作品はまた、protocを含む内因性の細胞骨格の3D免疫標識OL。我々は、分子組成、ローカリゼーション、および3Dで細胞構造の機能のより良い記述に貢献したいと考えて、これらのプロトコルを使用する。

TAMRAとラットテールコラーゲンIにラベルを付けると3Dコラーゲンネットワークの容易な作成と可視化を可能にします。 生体 10 で見つかったものに匹敵する組織とコラーゲンネットワークの形成における室温結果でスロー重合。 ここでは、回転楕円体として単一細胞としても、CT26癌細胞の細胞骨格の免疫蛍光染色するためのプロトコルを提示します。良い骨格を維持するには、バッファがそれぞれ未標識ファロイジンとタキソール、F-アクチンと微小管を安定させることが知られている薬で補充されています。加えて、細胞を固定し、同時に個々の微小管の可視化を妨げる可能性サイトゾル未重合チューブリン·プールを除去するために抽出される。この技術は、均等に細胞骨格関連タンパク質を可視化するために使用することができる。 3Dで、CT26細胞は細長いが特徴典型的な葉の形態を提示したときセル本体は、糸状仮足と葉状（ 図1および図2）に似F-アクチン細胞の豊富な突起逃れた。この細長...

この記事では蛍光さらなる修正と3D細胞培養のライブイメージングの両方に使用することができコラーゲンにラベルを付ける方法を紹介します。また、3D環境で培養された細胞の内因性細胞骨格タンパク質を可視化するために最適化されたプロトコルを提供する。

3Dで浸潤癌細胞の細胞骨格組織を明らかにする

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

本実験の目的は、3D培養におけるがん細胞の形態および細胞外マトリックスとの相互作用を観察することであり、まずラットテールコラーゲンを赤色蛍光DTRAで標識することで、3Dコラーゲンネットワークの可視化を可能にします。次に、単一細胞または多細胞スフェロイドとして増殖させたがん細胞を、Tamra標識した3Dコラーゲンマトリックスに封入します。その後、1〜3日間かけて細胞をコラーゲン全体に分散させることで、in vivoにおける周囲の3Dストロマへのがん細胞の浸潤および遊走を模倣させます。次に、細胞を固定し、適切な抗体とPhinを用いて免疫染色を行い、細胞形態および目的タンパク質の局在を可視化します。最終的に、共焦点顕微鏡を用いてサンプルのディープZスタック（深層Z軸連続画像）を取得することで、3Dで培養したがん細胞特有の形態や、3D細胞外マトリックスとの相互作用を解析できます。この手法は、長年2Dで解析されてきた3D環境における細胞構成要素の分子組成、機能、局在の詳細な記述に寄与し、細胞遊走分野における重要な疑問の解決に役立ちます。この手順を実演するのは、当研究室の技術員であるAnton Smoです。Tamaraを用いてコラーゲン1を標識します。まず、1 mLの使い捨てシリンジに、高濃度のラットテールコラーゲン1溶液1 mLを、気泡が入らないようにゆっくりと満たします。21ゲージの下皮注射針を取り付け、10,000 Daltonのタンパク質分子量カットオフを持つ、あらかじめ浸漬させた3 mL透析カセットにコラーゲンを注入します。この際、針でメンブレンを傷つけないよう注意してください。プランジャーを引き戻してカセット内の空気をすべて抜き、その後、1 Lのラベル緩衝液に対してコラーゲンを一晩透析させます。翌朝、透析カセットからコラーゲンを注意深く取り出し、透析済みコラーゲン溶液 1 mLと、冷えていて調製したばかりのTamra溶液 1 mLを、2 mLマイクロ遠心チューブ内で混合します。チューブをアルミホイルで包み、回転させながら一晩インキュベートします。翌朝、TAMRA標識コラーゲンをあらかじめ浸水させておいた透析カセットに移し、1リットルの標識緩衝液に対して一晩透析を行い、過剰な色素を除去します。次に、TAMRA標識コラーゲンを保存するため、透析カセットをpH 4の0.2% (v/v) 酢酸溶液1リットルに入れ、一晩透析させます。再び翌朝、マイクロピペットを用いてTAMRA標識コラーゲンを透析カセットからマイクロ遠心チューブに移し、コラーゲンの最終容量を測定した後、TAMRA標識コラーゲンの最終濃度を算出します。単一細胞の包埋に使用するコラーゲン溶液の初期量と濃度を考慮し、DYコラーゲンを4°Cで遮光保存します。実験に必要な2 mg/mLのTamaraコラーゲンミックスの量を決定し、その後、適切な量の10X PBSと1N 水酸化ナトリウムを混合します。次に、Tamara標識コラーゲンと未標識コラーゲンを1:6の比率で適切な量ずつ混合し、最終的な総コラーゲン濃度を2 mg/mLにします。次に、目的の細胞をFBS不含の冷却した細胞培地の適切な量に懸濁させ、それをコラーゲン混合液に加え、最終的な細胞密度を1×10⁵ cells/mLにします。混合液10 µLをpH試験紙で測定してpHを確認し、その後、Tamaraコラーゲン細胞懸濁液を100 µLずつガラスボトムディッシュに分注し、コラーゲンが白っぽいゲル状になるまで室温で30〜45分間重合させます。次に、コラーゲンに封入された細胞ドロップが浸るまで十分な量の培地を慎重に加え、細胞がマトリックス全体に遊走するのに十分な時間、37 °C、10% 二酸化炭素条件下でドロップを保持します。細胞を封入する場合、通常は1〜3日かかります。適宜希釈したコラーゲンを100 µLずつピペットで滴下します。ガラスボトムディッシュに混合し、ゲルの粘性をわずかに上げるため、コラーゲンを2〜5分間静置して重合を開始させます。次に、細胞ステロイドを回収し、新しいペトリ皿に移します。余分な液体を取り除き、細胞培地内でコラーゲンが希釈されるのを防ぐため、10 µLのTamaraコラーゲンミックスでステロイドを再懸濁します。次に、P 20ピペットを用いてコラーゲン懸濁ステロイドを回収し、100 µLのTEMAコラーゲンミックス液滴の中央上部に配置します。コラーゲンを2〜5分間短時間重合させれば、通常、OIDがコラーゲン液滴の上面および底面から100 µm以上離れた位置に保持されるのに十分です。もしステロイドが沈降する場合は、ディッシュを約2分間反転させた後、再び正立させてください。先ほど示したようにコラーゲンを重合させ、その後、コラーゲンステロイドドロップが浸るのに十分な量の培地を慎重に加えます。次に、免疫蛍光染色のために、細胞がマトリックス全体に遊走するようドロップをインキュベートします。まず、細胞培地を慎重に取り除き、ステロイドが埋め込まれたコラーゲンマトリックスをPBSで洗浄することから始めてください。次に、細胞を抽出固定バッファーでインキュベートします。さらに5分後、PBS中のPFAおよびスクロースを用いて細胞を30分間固定します。その後、細胞を洗浄します。次に、PBSで希釈した目的の一次抗体とともに細胞をインキュベートします。その後、マトリックスを30分ずつ3回洗浄します。3回目の洗浄後、PBSで希釈した二次抗体、Alexa結合Phin、およびDPIとともにマトリックスをインキュベートします。その後、マトリックスを再び洗浄し、余分な液体を除去して、皿の底部を満たすように封入剤を約500 microliters加えます。次に、24 millimeterのカバーガラスで各ドロップを封止します。この際、ドロップを強く押してマトリックスの構造を損なわないように注意してください。これでサンプルのイメージングが可能です。40倍対物レンズをコラーゲンドロップの中央に配置します。次に、蛍光ランプを用いて、XY軸およびxz軸の両方でサンプルの概観を確認します。その後、共焦点ライブイメージングモードに切り替えます。561ナノメートルのレーザーを使用し、コラーゲン繊維が現れ始めるまでガラス底からフォーカスを合わせていきます。この深さをZ = 0 µmと定義します。次に、対物レンズをZ = 0から100 µm上に上げるまで上昇させ、ガラス底の剛性によるテンションの影響を避けるため、z = 100 µm以上の位置にある細胞をイメージングします。ラット尾コラーゲンIをTamaraで標識することで、3Dコラーゲンネットワークの容易な調製と可視化が可能になります。室温での緩やかな重合により、ここでは赤色で示されるネットワークが形成されます。これは、青色で示されるチュブリンや緑色で示されるアクチンといった生体内の細胞骨格タンパク質と同等の組織化を呈しており、3Dマトリックス内で観察した際のこれらの画像に示されるように、免疫染色によって可視化できます。結腸腺癌CT 26細胞は、フィロポディアやラメロポディアに類似したf actinに富む細胞突起を伴う、伸長した細胞体を特徴とする典型的な間葉系形態を示します。この伸長した形態は、コラーゲンマトリックスに浸潤して細胞スフェロイドから脱出しようとする細胞においてより顕著に見られます。培養2日後、細胞は細胞スフェロイドから離れ、コラーゲン3Dマトリックスへの浸潤を開始します。これらの画像において細胞が3次元的に均一に分布しているかを確認するためには、すべての視野平面から収集したZスタックを解析することが不可欠です。例えば、最大XY投影として可視化した場合、スフェロイドとして培養されたCT 26細胞は、3Dコラーゲンマトリックスに広範囲に浸潤しているように見えます。しかし、XZビューを確認すると、実際には細胞はスフェロイドの体積と比較して限定的なZ間隔に浸潤しており、浸潤に優先的な領域があることが示唆されます。この代表的なステロイドは、実際にはディッシュのガラス底に近すぎたため、細胞が3Dコラーゲンマトリックスに浸潤するのではなく、この手順に従って2Dの硬いガラス上を這うことでステロイドから離れる結果となりました。TAMRAコラーゲンマトリックスに埋め込まれたGFP発現細胞のライブイメージングなどの他の手法を用いることで、細胞とマトリックス間の動的な相互作用や、細胞によって誘導されるマトリックスの変形を詳細に追跡することが可能です。

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Medicine

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大腸癌細胞の3次元モデルにおける侵襲性腫瘍微小環境の分子プロファイリングと<em&gt;生体外</em&gt;線維芽細胞

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三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

この方法は、スフェロイドから周囲の3Dマトリックスへの癌細胞の浸潤を評価します。 スフェロイドはハンギングドロップ培養法で作製し、基底膜材料とI型コラーゲンからなるマトリックスに包埋します。 その後、スフェロイドからの侵入が監視されます。...

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このプロトコルは細胞分裂の同期を統合することで効率的に 3 D コラーゲン マトリックス中の哺乳類の細胞分裂を研究生細胞イメージング、共焦点反射の時間分解顕微鏡を使用して 3 D...

哺乳類の細胞分裂量的共焦点反射顕微鏡を介して 3 D 行列

提示されたアプローチは、3DスフェロイドアッセイおよびT細胞細胞毒性における癌細胞浸潤を同時に評価する。スフェロイドは、足場のないアガロースマルチマイクロウェルキャストで生成されます。I型コラーゲンマトリックスにおける共培養および埋め込みは、同じ装置内で行われ、癌細胞浸潤およびT細胞媒介性細胞傷害をモニタリングすることができる。...

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

ここで提示される、スフェロイドイメージング装置の製造のためのプロトコルである。この装置は癌細胞スフェロイドの動的または縦方向の蛍光のイメージ投射を可能にする。プロトコルはまた癌細胞の浸潤の分析のための簡単な画像処理手順を提供する。...

3Dスフェロイドモデルにおける時間分解蛍光イメージングとがん細胞浸潤解析

がんの転移を研究するためには、ヘテロセルのクロストークを捉える3Dがんモデルが急務となっています。私たちの研究は、侵入と細胞空間分布の研究に使用できる足場および足場のない環境でのヘテロ多細胞間質-上皮の生成を示しています。...

上皮癌細胞のスキャフォールドフリー3D培養におけるヘテロ多細胞間質細胞による浸潤の促進

学ぶ 3Dコラーゲン基質中の浸潤癌細胞の細胞骨格組織の可視化法。ラット尾コラーゲンを蛍光標識し、共焦点顕微鏡で深部Zスタックを取得することで、細胞形態とタンパク質局在を解析します。

3Dで浸潤癌細胞の細胞骨格組織を明らかにする

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