無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

この手順の全体的な目標は、無傷の骨格筋線維のカルシウムスパークの特性を直接視覚化して測定することです。これは、最初にマウスから無傷の単一指屈筋線維を単離することによって達成されます。次に、筋繊維にインフルエンザoh 4:00 AMカルシウム感受性染料をロードして、カルシウム火花を検出します。

最後のステップは、スパークを記録し、データを分析することです。最終的に、共焦点顕微鏡ベースのイメージングを使用して、一過性浸透圧ストレスによって誘発されるカルシウム一過性を検出します。この方法は、骨格筋ジストロフィーと筋肉老化プロセスにつながるメカニズムに関する筋生理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

そこで、2人の大学院生、クリスティン・ゴッパーが健康的な摂取FDB繊維分離を実証し、上級研究員のパーク博士が浸透圧ストレス灌流とデータ分析を実証します。セットアップを開始するには、2チャンネル灌流システムを保持する3軸マイクロマニピュレーターを配置します。灌流システムは、使い捨てのルアーシリンジと3ウェイルアーが取り付けられています。

ロックストップコックは、灌流システムの一方のチャネルに等張性チロ溶液をロードし、もう一方のチャネルに低張性チロ溶液をロードします。マウスを安楽死させた後、重い解剖はさみを使用して、足首関節の上の脚を切り裂いて足を取り除きます。最小限のカルシウムチロ溶液で満たされた解剖チャンバーに足を置きます。

プランターの表面を上に向けて、足をチャンバーに固定します。腱を露出させて切断することにより、指屈筋またはFDB筋を解剖します。次に、腱をゆっくりと引き上げて、筋肉を周囲の組織から分離します。

遠位腱が筋肉の深層の個々の指に分岐する場所を見つけ、その位置で遠位腱を切断します。鉗子で腱をつかみ、FDB筋肉をコラゲナーゼ消化液の解凍アリコートでチューブに移します。インキュベーション後、FDBを含むチューブを摂氏37度のオービタルシェーカーに直立させて160RPMの速度で60〜90分間インキュベートし、消化したFDBを700マイクロリットルの等張性チロ溶液を含むチューブに移します。

次に、清潔なカミソリの刃を使用して、3つまたは4つの200マイクロリットルマイクロピペットの先端を取り外し、カットされていない200マイクロリットルのピペットチップを最小直径として、徐々に直径が小さくなるマイクロピペットチップを作成します。次に、最大直径のマイクロピペットチップから始めて、マイクロピペットチップを通してFDB筋肉を引き込みます。このアクションを数回繰り返します。

次に直径の小さい先端を持つマイクロピペットに切り替え、その先端を通して筋肉を数回引きます。壊れた繊維はこのプロトコルに使用できないため、繊維を過剰または過少に消化しないように、またマイクロピペットの先端の開口部に無理に通さないようにすることが重要です。繊維の損傷を避けるために最小直径の先端が使用されるまで、シリーズを続けます。

各チップは、繊維束がくっつかずに通過するのに十分な大きさである必要があります。このプロセスには約10分かかり、個々のFDBファイバーが見えたら終了します。次に、FDB繊維をチューブ内に軽くたたいて懸濁した後、カットした200マイクロリットルのマイクロピペットを使用して、1ミリリットルの等張性チロ溶液が入った35ミリメートルデルタTPG皿の中央に70マイクロリットルを移します。

次に、解剖顕微鏡を使用して、皿内の無傷の単繊維の数を決定します。必要に応じて、FDB繊維のアリコートを追加して、皿に3〜4本の無傷の繊維を取得します。残りの孤立した筋繊維は、摂氏4度で保存して6時間以内に使用できます。

以下のために di ローディング メッキされたFDB繊維を備えた皿から500マイクロリットルの等張チロ溶液を10マイクロリットルのインフルエンザoh 4:00 AMストックの入ったチューブに移します。混合後、それを皿に戻して、最終的なインフルエンザoh 4:00 AM濃度の10マイクロモルにします。1時間後、暗所で室温で筋繊維を60分間ダウンロードします。

500マイクロリットルのインフルエンザoh 4:00 AMに、カットされていない200マイクロリットルのマイクロピペットチップを使用して、等張性チロ溶液を3つのバッチで慎重に取り除きます。次に、等量の新鮮な等張性チロ溶液を追加します。この洗浄をさらに3回繰り返します。

ディッシュを共焦点顕微鏡に移し、実験用に明確な縞模様と滑らかなSarco leal膜を備えた無傷の繊維を選択します。マイクロマニピュレーターコントロールを使用して、灌流システムの先端を、ターゲットの筋線維から400〜500ミクロン離れ、筋線維の中心から外れた位置に配置します。等張性Tyrro溶液の流れを開始して、FDBファイバーが所定の位置に留まるようにします。

ファイバーが所定の位置に留まらない場合は、ディッシュ上の別のファイバーを見つけ、40 x オイル浸対物レンズを使用して灌流システムの先端を再配置します。アルゴンレーザーでインフルエンザoh 4:00 AMを興奮させ、発光信号を記録します。繊維に等張性チロ溶液を60秒間灌流することにより、浸透圧応力実験のベースラインを収集します。

その後、100秒間低張性Tyro溶液に切り替えて腫れを誘発し、その後、少なくとも10分間等張性Tyro溶液に戻します。.一般に、1つのデルタTPGディッシュ内の1つの無傷のファイバーに1つの浸透圧衝撃波のみが適用されます。浸透圧ストレス実験全体を通して。

テキスト プロトコルで説明されているように、カルシウム スパークの空間的局在を記録します。次に、新しい皿で新しい繊維を見つけ、浸透圧ショックプロトコルを繰り返してカルシウムの過渡性を誘発します。多数のXTラインスキャントレースを収集して、個々のカルシウムスパークパラメータの形態と速度論を評価します。

カスタム開発されたアルゴリズムは、一部の筋疾患モデルで関心領域を手動で特定する必要がある分析に役立ちます。あるいは、画像Jで公開されているスパークマスターを使用して、カルシウムスパークの運動特性と骨格筋におけるそれらの空間分布を定義することができます。骨格FDB筋線維を最初に等張性チロ溶液で処理し、次に低張性チロ溶液で処理し、次に等張性チロ溶液で処理しました。

ここでは、XYイメージングで観察されたスパークエピソードのヒストグラムを示し、筋線維が元の体積に収縮します。強力なカルシウムスパーク応答は、筋線維のサルコレンマの真下に観察されます。赤い破線で示された共焦点線の皮膚は、筋線維のサルコアマル膜の真下に配置されています。

浸透圧は目立たないカルシウム火花を誘発し、これはラインスキャンまたはXTモードで提示されます。カスタム開発されたスパークフィットアルゴリズムを使用したスパーク解析では、SRカルシウム放出フラックスに比例するカルシウム強度が示され、スパークの速度論または持続時間も示されます。インフルエンザの OH 4 ラインスキャン画像の 3 次元プロットは、空間時間モードで誘発される浸透圧ストレスの火花とその強度を示しています。

これは、若い健康なFDB筋線維に由来するカルシウムスパーク、老化したFDB筋線維からのスパーク、および若いジストロフィーMDXマウスFDB筋線維からのスパークのラインスキャンまたはXT画像です。老化した筋線維で発生する信号の減少に注目してください、一方、若いMDX筋線維は強力なカルシウムスパークを示しました。ここでは、野生型EDL筋からのカルシウムスパークと、ミトコンドリアのTMRE標識を示しています。

画像は、浸透圧変化の前後の過渡性を示しています。筋萎縮性側索硬化症またはLS筋からのカルシウムスパークがここに示されている。ミトコンドリアが損傷した領域、つまりTMRE信号が低い領域には、依然として強力なカルシウムスパークが潜んでいることに注意してください。

したがって、この手順の最も難しい部分は、良質で健康な筋繊維を得ることができることであり、また、効率的な方法で溶液を変更できる灌流システムを持つことができる必要があります。このビデオを見た後、孤立した筋繊維を使用して、カルシウム放出骨格筋の元素単位であるカルシウムスパークを測定する方法についてよく理解できるはずです。そして、これらのカルシウム放出イベントは、筋肉の健康状態や、筋肉の老化、糖尿病、筋ジストロフィーなどの多くの病態生理学的状態を評価するためのバイオマーカーとして確実に使用できます。