3.14: キイロショウジョウバエの胚と幼虫の収集、準備法

ショウジョウバエの胚と幼虫は操作が容易で、その発生は哺乳類を含む他の生物に存在するメカニズムによって導かれます。胚や幼虫の収穫と準備を学ぶことは、行動生物学から発生生物学までの多くの実験プロセスにおける予備的なステップです。 このビデオでは、ショウジョウバエの胚と幼虫の収集と収穫の標準的な方法、つまりこの汎用性の高いモデル生物の使用に不可欠な手順について説明します。

ショウジョウバエの胚の研究は、卵子の勾配として発現するmRNAから、前後のセグメント化されたボディプランを形成する遺伝子まで、遺伝子が発生を調節する方法について大きな洞察を提供しました。これらの遺伝子の一部は、ホメオボックス遺伝子のように、この昆虫と哺乳動物の間で高度に保存されています。

ショウジョウバエの胚の心のこもった性質は、彼らが過酷な環境や化学物質への曝露に耐えることを可能にし、それは彼らを研究することを非常に実用的にします。

受精後、1匹の雌のハエが1日あたり最大100個の胚を産むことができ、12〜15時間後に幼虫に孵化します。

ショウジョウバエの胚を操作するためには、まず胚を採取する必要があります。

胚は、「産卵カップ」と呼ばれることが多い産卵室に集められます。

敷設カップを組み立てるには、まず容器の一部に穴を開けるか切り取り、多孔質材料で覆って換気を可能にします。 次に、リンゴまたはグレープジュースの寒天プレートを入手し、イーストペーストで縞模様にし、プレートの中央を引っ掻きます。 イーストペーストの存在は産卵を誘発します。

ハエを産卵室にすばやく追加し、プレートが底になるようにチャンバーを反転させ、インキュベートさせます。 希望のインキュベーション時間後、卵室を反転させ、ベンチトップに数回叩きます。 ハエは底に落ち、一時的に方向感覚を失います。古い寒天プレートを、イーストペーストを重ねた新しいプレートにすばやく交換します。最も老化した胚を獲得するには、1〜3時間ごとにプレートを交換します。

プレートには、特に引っかき傷や酵母の近くに、何百もの胚があります。

各性別の20匹のハエは、1時間あたり100〜200個の胚を産む必要があります。これで、胚を収穫することができます。

胚採取に必要な道具は、サイズや複雑さが大きく異なりますが、ストレーナーやふるい、絵筆、蒸留水です。

まず、プレートを蒸留水に浸し、ペイントブラシで表面をやさしくブラッシングして、胚をほぐします。次に、混合物をふるいに注いで液体を濾過します。胚を水ですすいでください。

すすぎの後には、胚の硬い外膜、または絨毛膜の除去であるデコレーションがしばしば行われます。

形成は、絨毛膜鞘から胚を解剖することにより手動で行うことができます。あるいは、胚を50%漂白剤に入れることもできます。 背側付属器の消失によって指摘されるように、絨毛膜が溶解するのに2〜10分かかります。蒸留水で十分にすすいで、裸の胚が漂白剤によって損傷を受けていないことを確認します。デコレーションは、マイクロインジェクションやライブセルイメージングなどの技術の前提条件です。

胚の生物学、収集、収穫の感覚をつかんだところで、ショウジョウバエのライフサイクルの次の段階である幼虫に移りましょう。

ショウジョウバエの幼虫には、3つの「インスター」または脱皮段階があります。 最初のインスターは1日、2番目は別の日、3番目はさらに2日間続きます。 1番目と2番目の幼虫は、十字架を設置してから1〜3日後にバイアルの食品中に見つかります。 4日目に、3番目の幼虫はコンテナの側面を上に移動する、または「さまよう」、最終的に蛹と呼ばれる繭を形成します。

幼虫は、その想像上の円盤のために実験によく使用されます。 想像上の椎間板は、部分的に発達した器官であり、成虫のハエ全体の一部になることが知られています。例えば、想像上の目の円板は大人の目になり、触角の円板は触角になり、想像上の翼の円盤は翼になります。想像上の円盤の研究は、パターン形成におけるホメオボックス遺伝子の役割など、ショウジョウバエの重要な発見につながっています。

幼虫の収集は、ハエを特別なハウジングに移す必要がないため、胚の収集よりも簡単です。

個々の幼虫はピンセットまたはへらで取り除くことができます。初期段階の幼虫を大量に収集する場合は、幼虫よりも密度が高く、浮遊させるショ糖溶液を使用した別の収集方法を採用できます。

バイアルにスクロース溶液を加え、幼虫を上に浮かび上がらせます。バイアルをローテーターに置いて、食品を取り除きます。その後、ブラシやピペットで幼虫を取り出し、実験のために収穫します。

胚と幼虫の収集と採取の技術について説明したので、次はそれらを実験に適用する方法を見てみましょう。

移動性があるため、ショウジョウバエの幼虫は行動実験に使用できます。

ここでは、特定の条件下でショウジョウバエの自発運動行動を評価するために使用される「クローリングアッセイ」を示します。クロールアッセイは、運動機能に対する薬物の影響を観察するために、幼虫が移動する距離を測定します。採取された幼虫は、運動性を妨げると予測される薬物添加されたショ糖溶液に浸されます。

マイクロインジェクションは、環状DNAプラスミドの形でカスタマイズされた遺伝物質を挿入することにより、トランスジェニック変異体として知られる遺伝子組み換えショウジョウバエを作成する手順です。

これらの胚は、化学物質が損傷しないように、両面テープで物理的に転がすことによって角膜化されます。その後、チューブリンなどのタンパク質をコードするプラスミドを、GFPなどの蛍光レポータータンパク質と融合させた胚に注入することができます。その後、実験を行って、確立されたトランスジェニックフライ系統からの有糸分裂などの細胞プロセスを視覚化できます。

胚は、蛍光in situハイブリダイゼーションを通じて転写産物の存在を視覚化するために使用できます。

この実験では、蛍光顕微鏡法により、全胚の目的のmRNA転写産物の存在を観察します。胚は、デコリオネートする二相性溶液を使用して固定されるため、胚を染色用に準備します。裸の胚は最下層にあります。免疫蛍光染色後、蛍光顕微鏡を用いて目的のタンパク質の存在を確認することができます。

JoVEの胚と幼虫の収穫と準備のビデオを見ました。胚と幼虫の収集、収穫、調製、および初期段階の生物に適用されるいくつかの重要なアプリケーションを検討しました。ご覧いただきありがとうございます!