無傷アダルトゼブラフィッシュの脳における電気生理学的記録
2013年11月19日
本論文では、成人のゼブラフィッシュは、固定化された挿管、無傷の動物における記録と神経活動の操作を可能にするためのin vivo電気生理学的実験のために使用する方法について説明します。
この手順の全体的な目標は、無傷の成体ゼブラフィッシュの脳内の神経活動のin vivo記録を取得することです。これは、最初にトリカメチルスルホン酸の浴中塗布を通じて固定化、成体のゼブラフィッシュを得ることによって達成されます。2番目のステップは、固定化されたゼブラフィッシュに挿管することです。
次に、トリカ麻酔下で開頭術を行い、脳へのアクセスを提供します。最後のステップは、開頭術のウィンドウ内に一次電極を配置し、細胞外の脳活動を記録できるようにすることです。最終的にはin vivoで。
成体のゼブラフィッシュの電気生理学は、さまざまな薬理学的化合物や遺伝子変異がゼブラフィッシュの天然の神経学的活動の変化にどのようにつながるかを示すために使用できます。この方法は、正常な発達と遺伝子変異の場合の両方で、脳構造の変化が神経活動の変化にどのように影響するかについて、発生生物学と神経生物学の両方における重要な質問に答えるのに役立ちます。一般的に、この技術に不慣れな人は、脳組織に損傷を与えることなく頭を覆っている骨板のごく一部だけを取り除くために特別な注意を払う必要があるため、苦労するでしょう。
挿管カニューレは、魚への液体の導入を容易にします。このセットアップは、カニューレを動物の口の中に最適に配置するための柔軟性と硬さの両方を提供します。このセットアップでは、はさみまたはカミソリの刃でP 200ピペットチップの広い端から1.5センチメートルのセクションを取り外します。
次に、6cm×1mmのチューブを減圧弁に挿入します。次に、修正したピペットチップを直径8分の1インチのチューブの短い部分に挿入します。その後、チューブを使用してカニューレをピペットチップに挿入し、ピペットチップをルアーロックで所定の位置に保持できます。
実験の前に、プロフュージョンのセットアップを生息地の水で洗い流し、すべての気泡が除去されていることを確認しました。次に、開頭術の灌流セットアップに30ミリリットルの630マイクロモルトリカ溶液を追加し、2ミリリットルのトリカをチューブに通して、灌流開始時に動物にトリカが送達されるようにします。メインの豊富なセットアップでは、最初のチューブに50ミリリットルの生息地の水を追加します。
次に、残りの各チューブに必要な実験化合物を追加します。その後、挿管ベースの小さな穴にカニューレのセットアップを置き、幅1インチのキムワイプのストリップをタイトなスパイラルにねじり、キムワイプが両端に伸びるようにドレナージチューブに挿入します。この組織は、灌流された液体を除去し、電気生理学的記録を妨げる可能性のある挿管ベース内の液体の蓄積を防ぐための芯として機能します。
次に、チューブの一方の端をペトリ皿の大きな穴に挿入し、下端がすべての大量の廃棄物を収集するのに十分な大きさの不活性皿に伸びるようにします。この皿は、セットアップの流出貯水池として機能します。次に、一方の端が動物の腹部の近くにくるように組織を配置し、下部のエクステンションが皿に滴り落ちるようにします。
この完成した挿管ベースを解剖顕微鏡の近くに置きます。次に、カニューレのluロックをトリカンプロフュージョンチューブに接続します。この手順では、15 x 60 mm のペトリ皿に 630 マイクロモルのトリカ溶液を最大 4 分の 3 まで加えます。
次に、フィールドディッシュの重さを量ります。これは、動物を固定するために使用され、さらに麻酔を腹膜に注入することができます。次に、トリカを含む皿に動物を浸し、再び皿の重さを量ります。
次に、総重量から充填された皿の重量を差し引いて、魚の重量を計算します。動物が落ち着き、ほとんどの動きが止まるまで、動物をトリカ溶液にとどまらせます。魚をトリカ溶液に浸している間、34ゲージの針を含むNFIシリンジを使用して、魚の重量1グラムあたり1マイクログラムになるように十分な臭化パントニウムを引き出します。.
魚が落ち着いたら、幅の広い鉗子を使用して、魚の尾を事前に湿らせたスポンジに移し、横方向に配置します。次に、スポンジと魚を解剖顕微鏡の下に置きます。アイスキャンディーの棒で魚の背側を持ちます。
次に、パンケオンブロマイドを腹腔間投与します。今は細かい鉗子を使ってください。魚の下顎をつかみ、すぐに挿管ベースに移します。
動物の背側を上にしてワックスフォームに配置し、1ミリメートルのカニューレを口に挿入できるようにします。次に、細い鉗子を使用して魚を操作し、カニューレの周りの口を開きます。私たちのセットアップでは。
ベースにはストップが組み込まれており、カニューレを魚の口に3mm挿入することができました。所定の位置になったら、トリカを含む重力供給灌流チューブをオンにします。次に、キムワイプティッシュの3平方センチメートルの部分を切り取り、生息地の水と結合させます。
乾燥を防ぐために、ティッシュを動物の上に置きます。解剖顕微鏡の下で、魚は準備され、開頭術が行われるのを待ちます。この領域は、目の後ろにある暗い骨のプレートのように見えます。
次に、ハサミのバンの刃を1枚プレートの端に挿入し、脳を突き刺さずに骨を貫通するのに十分な力で押し込みます。次に、はさみを閉じて骨を切り取ります。その後、電気生理学記録のために骨片を取り除きます。
挿管を止めます。.コックを止めて、挿管ベースとトリカ点滴をつないでいるルアーロックを素早く外します。無傷の挿管セットアップを電気生理学顕微鏡に移し、灌流システムに接続します。
生息地、水、灌流を1分あたり1ミリリットルの割合で約1時間オンにします。マイクロマニピュレーターを使用してトリカを洗い流すには、電極の先端が動物の鼻孔または上顎の下のくぼみに挿入されるように二次電極を配置します。続いて、一次電極針を開頭術の開口部に挿入します。
次に、先端が視神経tum内でかなり表面的に配置されるように、針を組織に挿入します。電極のより深い位置は、0.1キロヘルツのローパスフィルタと1ヘルツのハイパスフィルタと共に、5、000ヘルツのサンプリングレートでデータ収集ギャップフリーモードのための小さな電気信号をもたらす可能性があります。生息地の水が最低45分間灌流されたときに、電気生理学的活動の記録を開始します。
実験薬を追加する前の少なくとも 15 分間、ネイティブ アクティビティのベースラインを記録します。この実験では、成体のゼブラフィッシュの天然の神経学的活動をモニターしましたが、この図は、記録期間を通じて約2〜10ミリボルトの小さな振幅を持つ視神経腫瘍の自発的なベースライン活動を示しています。15ミリモルPTZをシステムに導入された後、5分以内に分泌物のような自然てんかん型が発生し始めました。
PTZに継続的に曝露すると、最大15ミリボルトの一貫したパターン、大きな振幅の放電、その後のより小さく、より頻繁な活動のバーストが起こりました。この手順を実行する間、動物の取り扱いと開頭術の実施中は、忍耐強く、時間をかけることを忘れないでください。このビデオを見た後、無傷の成魚の脳内の神経活動のin vivo記録を取得する方法についてよく理解できるはずです。
これは、プロフュージョンシステムを使用し、固定された動物に開頭術を行うことによって達成されます。
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概要
本論文では、成体ゼブラフィッシュの完全な個体を用いて、脳内の神経活動をin vivoで記録する手順について解説します。この手法では、電気生理学的実験のために脳へアクセスする目的で、固定、挿管、および開頭術を行います。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 動物モデル
背景
- ゼブラフィッシュは、神経活動を研究するための価値の高いモデルです。
- in vivoでの記録により、脳機能に関する知見が得られます。
- 電気生理学的手法を用いることで、神経回路の操作が可能になります。
- 実験を成功させるためには、固定と挿管が不可欠です。
研究の目的
- in vivoでの神経記録のための信頼性の高い手法を開発すること。
- ゼブラフィッシュの脳活動に関する理解を深めること。
- ゼブラフィッシュを用いた神経生物学における今後の研究を促進すること。
使用方法
- 固定のためのトリメチルスルホニウム法の浴中適用。
- 固定したゼブラフィッシュへの挿管。
- トリカ麻酔下での開頭術の実施。
- 細胞外記録用一次電極の配置。
主な結果
- 成体ゼブラフィッシュの固定および挿管に成功した。
- 開頭術により脳へのアクセスを実現した。
- 脳活動の細胞外記録を取得した。
- 本手法により、神経活動の操作および観察が可能となる。
結論
- 記載された手順は、ゼブラフィッシュを用いたin vivo研究に有効です。
- このアプローチは、神経回路および行動の研究を前進させることができます。
- 今後の研究では、この手法を基にさまざまなアプリケーションへの応用が可能です。
よくある質問
産業界における重要性
成体ゼブラフィッシュを用いたin vivo電生理学的記録により、生理学的に妥当な条件下で神経活動を直接測定することが可能となり、神経薬理学および遺伝学的研究におけるメカニズムのデリスキング（リスク低減）を支援します。このアプローチは、幼生モデルと成体モデルのギャップを埋め、中枢神経系（CNS）創薬におけるターゲット検証および化合物評価の予測信頼性を向上させます。薬理剤に対するリアルタイムの神経反応をモニタリングできる本手法の能力は、初期段階のポートフォリオ・トリアージュやトランスレーショナルリサーチにおける重要なツールとしての位置付けを確立しています。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 個体レベルでの神経回路機能および薬理学的反応の解析を可能にします。
- 化合物への曝露や遺伝子変異を神経活動の変化に結びつけることで、機能的なターゲットバリデーションをサポートします。
- 直接的な神経的影響と全身的なアーティファクトを区別することで、メカニズム面でのリスク低減を促進します。
- 発達段階にわたる比較データを提供し、トランスレーショナルな連続性を確保します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- CNS活性化合物の定量的評価のための、検証済みin vivoプラットフォームを構築します。
- 薬理学的スクリーニングに適した、再現性のある細胞外神経活動の読み取り値を提供します。
- マルチチューブ灌流による複数の化合物の標準化された投与を可能にし、並行試験を実現します。
- 多様な神経活性剤に対するアッセイの拡張性とプラットフォームの再利用をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 神経活動のエンドポイントを疾患に関連する表現型と整合させ、トランスレーショナルなバイオマーカー開発を可能にします。
- 成体期における神経評価を可能にすることで、探索から前臨床検証までの継続性を提供します。
- 成熟した脊椎動物の脳における化合物の影響を明らかにすることで、リスクを調整した進展決定に情報を提供します。
- 完全な神経回路をモデル化することにより、CNS薬剤候補の予測価値を高めます。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期のターゲットバリデーションからリード化合物の同定、そして前臨床評価に至るまでの一連の創薬プロセスに統合されるものであり、特に中枢神経系（CNS）および神経活性物質のポートフォリオに有用です。
- 探索生物学： 生体内での神経回路変調および薬理学的影響に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： 化合物選別（トリアージ）のための定量的で再現性のある神経活動測定を提供します。
- 解析： 定義された電気生理学的指標を用いて、化合物の投与前後のベースラインと神経活動の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： ゼブラフィッシュの幼生および成魚のデータを橋渡しし、バイオマーカーの整合性と疾患モデリングを実現します。
- エンタープライズ再利用： 様々な神経薬理学プログラムに適応可能な、再利用可能な生体内電気生理学プラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：CNSターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：再現性と研究間の比較可能性を確保するため、in vivo神経記録を標準化します。
- 戦略的価値：早期に機能的リードアウトを提供することで、go/no-go判断の精度と資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：神経活性化合物および遺伝的ターゲットのリスク調整済み優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- ゼブラフィッシュの取り扱い、麻酔、および微小外科的開頭術に関する専門知識が必要です。
- 特殊な電気生理学用計測機器および灌流システムを必要とします。
- データの比較可能性を確保するため、チーム間での厳格な標準化が不可欠です。
- ゼブラフィッシュの系統や発生段階に応じて、調整が必要な場合があります。
- 脳組織の損傷を防ぎ、データの完全性を確保するために、慎重な取り扱いが不可欠です。
