Name: ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T21:00:00.000+00:00
Duration: 24 min 2 s
Description: 学ぶクロマチン免疫沈降と質量分析を組み合わせたChroPアプローチによる、機能的に異なるクロマチンドメインのプロテオーム組成の解析手法。この方法は、ヒストン修飾と関連タンパク質の同定・定量を可能にし、転写制御メカニズムの理解に貢献します。

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この研究は、もともとモル細胞プロテオミクスに掲載されました。 soldoの複数形M.およびクロマチン機能ドメインのBonaldi T.ザ·プロテオミクス研究は、異なるヘテロクロマチンコンポーネントのMCPの中で小説相乗作用を明らかにしている。 2013; 12：64-80。 ©生化学分子生物学のためのアメリカの社会。私たちは、原稿の重要な読書のためのロベルタNoberini（技術とIEOのイタリアの研究所、イタリア）に感謝。結核作業はジョバンニArmenise ​​ - ハーバード財団キャリア開発プログラム、がん研究のためのイタリアの協会と厚生労働省のイタリアからの補助金によってサポートされています。 MSの作業はFIRCフェローシップによってサポートされていました。

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<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).</li>
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<li>Bannister, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+recognition+of+methylated+lysine+9+on+histone+H3+by+the+HP1+chromo+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain.</a> Nature. 410, 120-124 (2001).</li>
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<li>Ernst, J., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+chromatin+states+for+systematic+annotation+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome.</a> Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).</li>
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<li>Young, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+characterization+of+combinatorial+histone+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High throughput characterization of combinatorial histone codes.</a> Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).</li>
<li>Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+characterization+of+human+histones+in+the+H2A+gene+family+by+top+down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).</li>
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利害の対立が宣言されていません。

我々は最近ChroP、クロマチンのタンパク質成分の大規模な特性評価のための定量的な戦略を記載している。 ChroPは、その強度から利益とそれぞれの限界を克服し、エピジェネティックなフィールドは、チップとMSで使用される2つの相補的なアプローチを組み合わせています。深いシーケンシング（チップ配列）に結合されたチップは、数ヌクレオソーム35の解像度でヒストン修飾のゲノムワイドなマッピングが可能。それらの感受性に有利で ​​あるが、抗体に基づくアッセイは、同様の変更を区別する能力およびヒストンコード36のコンビナトリアル態様の分析において制限されている。 MSは単独で、hPTMsの包括的かつ公平な分析を提供し、それらの組合せ9では 、これまでの遺伝子座特異的なPTMのpattersに関する情報の欠如と、その結果として、バルククロマチンの解析に適用したが、一方。私たちは、機能的に分離するために、チップの修正版を採用ヒストンのPTMパターンと非histonicタンパク質を特徴づける明確なクロマチンドメインおよび質量分析法を具体的にCOに富む。 <p class="jove_...

クロマチンはすべてのDNA媒介プロセスの主要なテンプレートとして関与している非常に動的な核タンパク質複合体である。ヌクレオソームはクロマチンの基本的な繰り返し単位であり、DNAの147塩基対が、1,2ラップ回される各カノニカルヒストンH2A、H2B、H3及びH4、2分子を含有するタンパク質性八量体コアからなる。すべてのコアヒストンは、ヌクレオソームの外に突出している球状ドメインで柔軟なN末端 ​​「テール」として構成されている。クロマチン構造とダイナミクスを調節するための主要なメカニズムの一つは、主にヒストン3,4のN-末端に生じる共有結合性翻訳後修飾（PTMを）に基づいている。ヒストン修飾がヒストン-DNA間、またはヌクレオソーム間の接触を変化させることにより、高次クロマチン構造を変化させるため、DNA結合タンパク質（ シスメカニズム）のアクセスを制御することのいずれかによって機能することができ、又はdockinとして作用することにより調節タンパク質のために、単一のユニット、または多量体複合体に埋め込まれたようなグラム·サイト。そのような調節タンパク質は、異なる方法でその機能を発揮することができる：直接遺伝子発現（ すなわち、TAFタンパク質）を調節することによって、またはヌクレオソーム位置決め（ すなわち、クロマチンリモデリング複合体）を変えることにより、又は他のヒストン残基を修飾することにより（メチルトランスフェラーゼまたはアセチルを有する、すなわちタンパク質を転移酵素活性）（ トランスメカニズム）5。特定のクロマチン座で明確なPTMパターンクラスタは異なる部位で異なる修正が基本となるDNAの機能状態を仲介する分子コードを生成するために相乗作用がありという仮説の精緻化につながっていることを観察。 「ヒストンコード仮説は、「年間で大規模なコンセンサスを得ていますが、その実験的検証は技術的な限界6,7によって戻って開催されました。 質量分析（MS）ベースのプロテオミクスとして浮上しているヒストン修飾パターンをマッピングすると、クロマチン結合タンパク質8を特徴づけるための強力なツール。 MSは、ペプチドの実験と理論質量との間の特定のΔmassとして変更を検出します。個々のヒストンのレベルでは、MSは、それらの9月14日の間で新たな修正解きほぐすinterplaysの検出を可能に、PTMをマッピングする公平かつ包括的な方法を提供する。 近年、多くの戦略は、無傷の有糸分裂染色体15、可溶性hPTM結合タンパク質16-18の同定および特定のクロマチン領域の単離および分析の特徴付けを含む、クロマチンのプロテオミクス組成を分析するために開発されている（ すなわちテロメア）19,20。しかし、ヒストンPTMを、変異体、およびクロマチン関連タンパク質間の遺伝子座特異的相乗効果の調査はまだ不完全です。ここでは、（ChroPという名前の新しいアプローチを説明します我々は効率的に機能的に異なるクロマチンドメインを特徴づけるために開発されたことをCHRO MATIN のP roteomics）21。このアプローチは、濃縮されたサンプルの効率的なMSベースのプロテオミクス解析のために、クロマチン免疫沈降（チップ）、エピジェネティック研究に使用される十分に確立されたプロトコルを適応させる。我々は、入力およびMSによって対処かごとして用いるクロマチンの種類に応じて、2つの異なるプロトコルを開発した。特に：1）MNaseで消化した未定着ネイティブクロマチンのチップは、モノヌクレオソームを精製するとCO会合hPTMs（N-ChroP）を解剖するために採用されている。 2）超音波処理によって断片化、架橋クロマチンのチップは、タンパク質（X-ChroP）を結合すべての共同豊かクロマチンを特徴づけるSILACベースinteractomics戦略と組み合わせて使用​​されている。ここでは、免疫沈降ステップのための餌としてのH3K9me3を使用して、ヘテロクロマチンを豊かにし、研究するための、N-とX-ChroPの組み合わせを示している。 ChroPの使用が拡張することができるこのようにエピジェネティクスでの様々なアプリケーションへの道を切り開いて、明確なクロマチン上の領域、または別の機能的状態への移行時に、同じ領域内のクロマチン組成の変化のどちらかを研究する。

<table><tbody><tr><td>DMEMの&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>SILAC DMEM</td><td>M-Medical</td><td>FA30E15086</td><td></td></tr><tr><td>透析 FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>リジン 0 (12C6 14N2 L-リジン)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>アルギニン 0 (12C6 14N4 L-アルギニン)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6969</td><td></td></tr><tr><td>リジン 8 (13C6 15N2 L-リジン)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>68041</td><td></td></tr><tr><td>アルギニン 10 (13C6 15N4 L-アルギニン)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease</td><td>Roche</td><td>10 107 921 001</td><td></td></tr><tr><td>完全、EDTAフリー プロテアーゼ阻害剤 カクテル錠</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 3 透析チューブ、3.5K MWCO、18mm フラット幅、長さ 50 フィート</td><td>Spectrumlabs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒストンH3トリメチル化K9-ChIPグレード</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr>ヒ<tr><td>ストンH3ペプチドトリメチルK9&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab1773</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12%&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;ビストリスゲル&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>コロイドブルー染色キット</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>LDS Sample Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Formaldheyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Aceti anhydride-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175641-1G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド &GE;99% (HPLC)、結晶性</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>シーケンシンググレード修飾トリプシン、凍結 100 &mu;g (5 &times; 20 &mu;g)</td><td>プロメガ</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>ナノスプレーOD360&mu;メートル×ID 75&mu;m、ヒントID 8 &mu;m コーティングされていない Pk 5</td><td>Microcolumn Srl</td><td>FS360-75-8-N-5-C15</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 & micro;m&nbsp;&nbsp;15% C</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.aq.</td><td></td></tr><tr><td>炭素抽出ディスク、47 mm</td><td>Agilent Technologies</td><td>12145040</td><td></td></tr><tr><td>陽イオン抽出ディスク</td><td>Agilent Technologies</td><td>66889-U</td><td></td></tr></tbody></table>

chropアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

クロマチンは様々なDNA依存性プロセスを制御するDNAやタンパク質で作られた非常にダイナミックな核タンパク質複合体である。特定の領域におけるクロマチン構造および機能は、転写因子、およびDNAメチル化を含むヒストンの翻訳後修飾（hPTMs）および変異体、クロマチン結合タンパク質の局所的な濃縮によって調節される。個別の機能領域でのクロマチン組成のプロテオミクス特性評価は、これまで質量分析（MS）によるその後の詳細な分析のための適切な純度と量でそのようなドメインを豊かにするために、効率的なプロトコルの不足によって妨げられてきた。取クロマチン免疫沈降は、その機能、hPTMs、変異体および共同関連する非histonicタンパク質の面で明確なクロマチン領域を分離するために使用され、それによって我々は、ここにChroP（CHRO MATIN のP roteomics）という名前の新 ​​たに設計されたクロマチンプロテオミクス戦略を、している記述MSにより分析した。我々は彼を説明ヒストンH3上のリシン9のトリメチル化の存在によってマークされた転写サイレントヘテロクロマチン領域に濃縮および分析のためのChroPのの設定、再。達成された結果は、徹底的にヘテロクロマチンプロテオームを特徴付けるChroPの可能性を実証し、クロマチンの異なるタンパク質決定因子が相互作用し、遺伝子座特異的構造的および機能的な構成を確立するために、相乗作用方法を理解するための強力な分析戦略としてそれを証明する。

クロマチン免疫沈降は、ゲノムに沿って、タンパク質やヒストン修飾の局在をプロファイルするために使用される強力な手法です。プロテオミクスと同等で、チップは、目的の変更またはタンパク質と一緒に免疫沈降「餌」として使用される質的にも量的にhPTMs、ヒストン変異体およびクロマチン結合タンパク質を同定するために、MSベースのプロテオミクスが続いている。 図1Aに概説したN-ChroPアプローチにおいて、クロマチンをMNase（ 図1B）で消化し ​​た天然のChIPは、別個の機能ドメインクロマチン大部分から精製するための入力として使用される。モノ - ヌクレオソームに富む消化したクロマチンは、特定の抗体と共にインキュベートし、免疫精製タンパク質を、SDS-PAGEによって分離されている。図の例では、のH3K9me3、サイレントクロマチン32,33のマーカーは、アプローチを設定するために使用されます。選択は、事実に基づいていると、両方の機能的役割だけでなく、そのタンパク質相互作用因子のいくつかは十分に説明されています。また、完全なヌクレオソームは、正しい化学量...

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

この手順の全体的な目的は、機能的に異なるクロマチンドメインのプロテオミクス組成を特性評価し、異なる要素がどのように相乗的に作用して転写状態を決定するのかを理解することです。これは、まず培養細胞から核を調製し、酵素的または機械的な手段によってクロマチンを最適な長さの断片に消化することで達成されます。次のステップでは、ヒストンの翻訳後修飾または目的の領域を特異的に標識することが知られているタンパク質に対するベイト抗体を用いた免疫沈降により、バルククロマチンから特定の機能的ドメインを精製します。次に、免疫精製されたクロマチンタンパク質をSDS-PAGEで分離し、質量分析の前にインゲル消化を行います。続いて、高分解能装置を用いて液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）を行います。最終的に、質量分析の生データを専用ソフトウェアで解析し、その後、スペクトルを手動で確認することで、ヒストン修飾および共濃縮タンパク質の同定と定量を行います。これらは、それぞれインプットに対する免疫沈殿物質中の相対量計算、または可溶性ペプチドを競合剤として用いたSLAC比および競合実験に基づいて行われます。これにより、ヒストン修飾パターンの相互作用と分散に関する知見が得られ、特定のクロマチン領域と、それによってリクルートされる核内相互作用因子が、すべて協調的に作用していることが分かります。遺伝子発現に調節効果を持つ特定のクロマチン景観を定義する上で、可溶性相互作用因子やヒストン修飾を対象としたin vitroスクリーニング（プルダウン法など）に基づく既存の手法に対するcropの主な利点は、ヒストンペプチドまたは再構成クロマチンテンプレートを使用することで、より天然に近い、非人工的な条件下で遺伝子座特異的なクロマチン組成を調査できる点にあります。cropの応用は、他のモデルシステムや時間依存的な研究にまで拡張することが可能です。例えば、ある種の摂動に反応して全般的な転写応答を示す細胞株にcropを用いることができます。この手順を実演するのは、私の研究室のポストドクターであるMonica Sodiです。N chip法に用いる核は、無標識の細胞から調製します。He A S3細胞は、1回の実験につき1×10⁸〜2×10⁸個を使用します。細胞を回収するには、50 mLチューブに5×10⁷個の細胞を4本分ずつ分注し、4°Cで340 ×g、10分間遠心分離します。氷冷PBSで細胞を洗浄し、上清を捨てて再懸濁します。各細胞ペレットを8 mLの溶解バッファーに懸濁し、15 mLチューブに移します。回転盤を用いて4 °Cで10分間インキュベートします。次に、各細胞溶解液をショ糖クッション上に慎重に注ぎ、スイングローターを用いて4 °Cで3,270 ×g、20分間遠心分離し、核と細胞質を分離します。上清を捨て、

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用分析のための方法です。...

クロマチンの相互作用のマッピングと転写調節を理解するためのペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用の解析

質量分析法の進歩により、組織の宿主におけるタンパク質発現および変更のハイスループット解析を可能にした。細胞下分画と疾患モデルと組み合わせることで、定量的質量分析法とバイオインフォマティクス、生物学的システムに新しい特性を明らかにすることができます。本明細書に記載される方法は、心臓病の設定でクロマチン関連タンパク質を解析し、他に容易に適用可能である...

病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析

特定のゲノム領域に関連する分子の同定は、これらの領域の機能の制御メカニズムを理解するために必要です。このプロトコルは、特定のゲノム領域に関連するタンパク質およびRNAの同定のために、遺伝子操作されたDNA結合分子媒介クロマチンimunoprecipitation(enChIP)を実行する手順を説明しています。...

enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離

ここでは、最適化された高スループット チップ シーケンス プロトコルと冷凍腫瘍組織や細胞からゲノム...

腫瘍組織に高スループット チップ シーケンスを用いたクロマチン状態のゲノム マッピングの統合プラットフォーム

これ以降のプロテオーム解析の架橋クロマチンのシーケンス固有のキャプチャに依存する特定のターゲット遺伝子の新規 DNA...

交配の適応は哺乳類細胞プロテオミクスのクロマチン関連タンパク質の捕捉します。

タンデム クロマチンのステップバイ ステップ プロトコルについて述べる免疫沈降配列 (tChIP-Seq)...

TChIP-Seq: 細胞型特異エピゲノムのプロファイリング

CUT&amp;RUNおよびその変異体は、クロマチン上のタンパク質占有率を決定するために使用することができる。このプロトコルは、単一細胞uliCUT&amp;RUNを使用してクロマチン上のタンパク質局在を決定する方法を説明しています。...

標的下での超低入力切断とヌクレアーゼを用いた放出を用いたクロマチン上の単一細胞因子局在化

このプロトコルは、トポロジー的会合ドメイン(TAD)の境界や、調節と他のDNA配列要素との間の長距離クロマチン相互作用など、メガベースサイズの標的ゲノム領域の3D組織を高解像度で特徴付けるために使用されるCapture Hi-C法について説明しています。...

キャプチャHi-C による 高分解能3Dクロマチン構成の解読

遺伝子発現は、遺伝子プロモーターと遠位調節要素との相互作用によって調節される。ここでは、低入力のCapture...

希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

私たちは、ユークロマチン、ヘテロクロマチン、RNAP...

高密度核環境下のクロマチン調査のための多ラベル単分子局在顕微鏡プロトコル

学ぶクロマチン免疫沈降と質量分析を組み合わせたChroPアプローチによる、機能的に異なるクロマチンドメインのプロテオーム組成の解析手法。この方法は、ヒストン修飾と関連タンパク質の同定・定量を可能にし、転写制御メカニズムの理解に貢献します。

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

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