2014年2月25日
ここでは、脳室下帯と個々の成体マウスの歯状回から、付着性単層またはニューロスフェアのいずれかとして、神経前駆細胞培養を同時に生成するための詳細なプロトコルを記述します。
この手順の全体的な目標は、個々の成体マウスの脳室下ゾーンと歯状回から、接着性単層またはニューロスフェアとして神経前駆細胞培養物を同時に生成することです。これは、最初に個々の成体マウスの脳を切除することによって達成されます。2番目のステップは、脳室下ゾーンをマイクロディスセッションし、回領域を歯状にすることです。
次に、組織を単一細胞懸濁液に解離します。最後のステップは、前駆細胞を接着性単層またはニューロスフェアとして培養することです。最終的に、Neuros Sphere Assay と接着性単層培養システムは、成体神経幹細胞の増殖または分化の可能性を判断するための貴重なツールです。
インビトロでは、この方法により、成人の神経新生分野におけるいくつかの非常に興味深い問題に対処することができます。これにより、個々の動物の細胞を見て比較することができ、これは、個人差を見る文脈、または例えば、個々のトランスジェニックマスクまたはノックアウトマスクとそれらの対照群の違いを見る文脈で興味深いものです。私のグループの上級科学者であるタラ・ウォーカーは、脳解剖の前にこの方法を提示します。
中型および小型のイノシシで、ガラス製の牧草地用ピペットを炎の中で回転させて、端が丸くなるまで火で磨いたピペットを準備します。その後、オートクレーブで滅菌します。まず、PBSが入った10センチメートルのプラスチック製ペトリ皿に脳を移します。
脳を低倍率の解剖顕微鏡の下に置き、脳を腹面に配置したシャーレを置きます。その後、細かい湾曲した鉗子を使用して、小脳を保持しながら嗅球を取り除きます。次に、脳を背側に回転させます。
視交叉のレベルで脳に冠状切開を行い、メスでSVZをマイクロダイセクトします。脳の吻側部分を皿に当てて、切断された冠状面が上を向くようにします。より高い倍率で、セプタムを取り外して廃棄します。
次に、細く湾曲した鉗子の片方の刃の先端を側脳室の側方角に配置することにより、心室を囲む組織の薄い層であるSVZを解剖します。脳梁ともう一方のブレードのすぐ下、心室に隣接する組織に約1ミリメートル。鉗子を皿の基部と心室の腹側に向かって押し下げて、小さな三角形の組織片を取り除きます。
その後、解剖したSVZを氷上のシャーレに置き、シャーレ内の脳の甘えん坊部分であるDEGの場所をマイクロダイセクションし、解剖顕微鏡下のメスを使用して縦方向の裂傷に沿って切断します。小脳と染料のセファロンを取り除きます。顕微鏡の焦点を合わせ直して、DGの周囲の境界が見えるようにします。
dgを取り外すには、27ゲージの針の先端を挿入し、DGとアーメンホーンの境界に沿ってスライドさせます。次に、細い鉗子を使用してDGを周囲の組織から解放します SVZ組織解離用。メスの刃を使用して、大きな破片がなくなるまで組織を1分間ミンチします。
その後、復活します。ミンチ組織を1ミリリットルのEDTAでプレウォーム0.05%トリップスで懸濁します。.その後、15ミリリットルのチューブに移し、摂氏37度に設定された水浴中で7分間インキュベートします。
酵素反応を止めるには、DNAスワンを含むトリプシン阻害剤を1ミリリットル加え、チューブをフリックして内容物を混合します。次に、懸濁液を300Gで5分間遠心分離し、傷跡を残してペレット化します。その後、セネットはペレットを1ミリリットルの成長培地に再懸濁し、グリで関連付けます。
P 1000ピペットを使用して約7〜10回ピペッティングします。次に、増殖培地を総容量5ミリリットルまで加え、細胞懸濁液を40マイクロメートルのふるいに通して、破片や関連しない組織塊を取り除きます。その後、300Gで5分間遠心分離します。
supinateとreusを捨てます。得られたペレットを200マイクロリットルの成長培地に懸濁して、DG組織解離を行います。メスの刃を使用して、大きな破片がなくなるまで約1分間組織をミンチにします。
次に、ミンチ組織を予熱したPDD酵素ミックスに移します。摂氏37度で20分間インキュベートし、3〜5分ごとにチューブを反転させて混合します。次に、中口径のファイヤーポリッシュ牧草用ピペットを使用して組織を10回静かに上下させて機械的に解離させ、さらに摂氏37度で10分間インキュベートし、3〜5分ごとにチューブをフリックして混合します。もう。
小さなイノシシの火で磨かれた牧草地のピペットを使用して、組織を静かに10回ピペッティングして、組織を機械的に解離します。その後、130 gで5分間遠心分離します。その後、 ?? 酸を取り出し、ペレットを1ミリリットルの緩衝液に再懸濁します。.
緩衝液で最大10ミリリットルを作ります。130 GSで5分間遠心分離した後。S上清を取り除き、ペレットをコールごとに20%の5ミリリットルに再懸濁します。.
その後、450GSで15分間遠心分離します。スナットを取り外し、ペレットを10ミリリットルのバッファーに再懸濁します。最後に、130GSで5分間遠心分離し、付着培養用の成長培地200マイクロリットルにペレットを再懸濁します PDLラミンENCコーティングされた96ウェルプレートの各単一ウェル内の細胞の200マイクロリットルの細胞をプレート化します スフェ培養用のプレートは、成長で希釈し、中程度から20ミリリットルで、コーティングされていない96ウェルプレートの上にウェルあたり200マイクロリットルをプレートし、その後、6〜12後に5%CO2で摂氏37度でインキュベートします日は、直立光学顕微鏡に取り付けられたIPグラディを使用してニューロスフェアの直径をカウントし、測定します。
この図は、成体マウス前駆細胞を接着性単層培養物として、またはSVZおよびdgのニューロスフェアとして培養できることを示しています。SVZからは、個々のマウスのDGと比較して、有意に多くのニューロスフェアが生成されることが見られ、SVZおよびDG前駆細胞も、in vitroでの脱分極に対して異なる反応を示し、長期の増強を確認します。ニューロスフィアは10の通路で拡大したことが示されています。
ニューロスフェアは、この手順に従って、赤色のGFAP陽性アストロサイト、赤色のO4個の陽性オリゴデンドロサイト、赤色の2つのAB陽性ニューロンのマッピングで示されるように、ベータ3つのチューブリン陽性ニューロンに分化することができる。細胞またはニューロスフェアを数世代にわたってパッケージングしたり、ニューロスフェアの分化とそれに続く組織学的分析などの他の方法を実施することができる。これは、マルチポテンシャルや長期的なポテンシャルなどのさらなる質問に答えるのに役立ちます。
この記事では、成体マウスの側脳室帯および歯状回から神経前駆細胞培養を生成するためのプロトコルを提示します。これらの培養は、接着性モノレイヤーまたは神経球として確立でき、成体神経新生を研究するための貴重なツールを提供します。
Simultaneous isolation and culture of neural stem cells from both the subventricular zone and dentate gyrus of individual mice enables direct, paired analysis of proliferation and differentiation potential. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence in neurogenesis research, facilitating robust target validation and translational continuity for CNS drug discovery portfolios.
This dual-culture method bridges early discovery and preclinical research by enabling direct, quantitative analysis of neural stem cell potential from individual animals.