Name: 乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 24 s
Description: 学ぶ乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング手法。マイクロ流体マイクロアレイとデュアルラベルプローブを用いて、エストロゲン受容体が制御するマイクロRNAを同定し、乳癌の分子メカニズム解明に貢献します。

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我々は彼らのmiRNAの専門知識を共有するため、博士カリンEdvardsson、カロリンスカ研究所、スウェーデン、博士Eylem Aydogduに、LC科学のmiRNAマイクロアレイプラットフォームへのアドバイスを提供するため、ヒューストン大学博士Xiaolianガオ、ヒューストン大学に感謝しています。この刊行物で報告された研究が受賞番号R01CA172437の下で国立衛生研究所の国立癌研究所によってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。この作品はまた、合意の下で、テキサスエマージングテクノロジーファンドからの補助金によって支えられている。 300-9-1958。

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著者らは、開示することは何もありません。

乳癌細胞におけるmiRNAのホルモン調節する機構を決定することは、この疾患を理解するためのプラットフォームを提供することができ、乳癌の潜在的な治療を提供することができる。ホルモン作用のための最適条件を提供するために、これらの細胞を培養することは非常に重要である。ここで、目的のホルモン（エストロゲン）が治療前に除外し、E2の最適用量について説明したが、治療中に適当な時間のために使用されたことをしたことを確実にするプロトコル。他のホルモンおよび成長因子の効果は徐々に血清レベルを低下させ、そのホルモン、サイトカインおよび増殖因子のほとんどが取り除かれているFBSでDCC-FBSを用いて最小限に保った。フェノールレッドを含まない培地は、さらに、フェノールレッドがエストロゲン活性を有し、細胞株20,21内の特定の機能に影響することが報告されていることを考えると、他の非ホルモンの影響を最小にするために使用した。ホルモンに対する細胞の曝露時間は非常に重要である。遺伝子のエストロゲンに関連する調節のために、以前の24 hrexposureは、乳癌細胞1,18における直接の標的遺伝子の有意な応答を生じることが示されている。 miRNAは、RNAポリメラーゼIIによって転写されるので、mRNAのように、これはまた、miRNAの直接の調節を検出するための適切な時点であると考えられる。なお、これらのmiRNAは、乳癌細胞におけるこれらの公知のER標的の発現にどのように影響する場合には、まだ決定されていない。 miRNA発現プロファイリングが原因のmiRNA、成熟miRNA配列は、プリmiRNAおよびプレmiRNAでも見つけることができるという事実の相対的なサイズが小さい挑戦すること、およびため、そのGC含量22内の不均一性のことができます。いくつかのプロファイリング技術および化学物質はこの困難を克服するために使用されてきた。これらの中で、マイクロアレイおよびqPCR分析の異なるアプローチ（ 図2）である。マイクロアレイは広く全ゲノム肛門のために受け入れているがysis、それは偽陰性を提供することができ、化学から印刷技術23に至るまで、可能なプラットフォーム間の相違が存在する。 mRNA転写物の何万と比較して、何千もカウントされる比較的少数のmiRNA遺伝子を解析する際にも、正規化処理は課題を提示する。定量PCRは、一方では、より感受性であり、少数の遺伝子があるとみなされるべきであるときに良好に適用される。プレートごとに1つの技術的反復で、大きな384ウェルプレートにおいて実施ところが、複数のプレートは、分析が高価になり、各試料について分析する必要がある。また、我々の手で、より多くの偽陰性の結果は、マイクロアレイと比較して、DLP-LDA分析を用いて得た。成熟miRNA配列がプリmiRNAおよびプレmiRNA配列中に存在することを考えると、それはPCR法24を用いてこれらの転写物を区別するために重要である。 DLPプローブは、事前のmiRNA、およびSPのためにも利用できますecificプライマーはまた、シアニン染料定量PCR技術を用いて、異なる変異体の成熟または前駆体を排除するように設計することができる。 定量PCRは、プロファイリング結果から発現差の検証のための黄金の標準です。定量PCRの有効性は、しかしながら、RNA抽出、RNAの完全性（品質）、cDNA合成、プライマー設計、検出方法（化学）、およびデータ正規化のための1,22,25参照遺伝子を含むいくつかのパラメータに依存する。短いmiRNA配列の長さがはるかに別のプライマー設計のための余地を与えないので、miRNAの分析のためのプライマー設計のための選択肢は非常に限られており、唯一つのプライマーは、この短い配列内に保持することができる。従って、 図2に示されるような別の操作が必要とされている。技術的反復は、増幅方法および使用されるプロセスの堅牢性を検証するために重要である。生物学的複製は、一般的な生物学的variatioの表現のために必要とされるnは、リガンド処理し、細胞内で見られた効果が再現可能であることを示すために変数の応答を含む。我々の経験に基づいて、細胞培養の間のmiRNA発現の変動が発生する可能性があります。通常、これらの違いは1.3倍未満であり、その平均値とそれに対応するSDは、自然と技術の変化を識別します。この変化は、細胞密度および細胞機能が通路に通路から変更される可能性があるという事実を含む様々な要因から生じうる。 p値が0.05未満である場合、リガンド処理から生じる統計的に有意な表現を識別するために、広く受け入れられている意義がある。ここで、両側分布および二標本不等分散パラメータを用いて生物学的および技術的反復にスチューデントt検定が使用されている。他のT-テストパラメータが存在し、選択は実験装置26に依存します。 成熟miRのホルモン規制を評価する上で詳細なプロトコル乳癌細胞におけるNAが提供されている。プロファイリングにおけるこれらのmiRNAの表現を検証し、重要な技術や化学が明確に説明されています。乳癌細胞におけるmiRNAの研究のために選択された技術は、最終的に正確に調査されているかに依存する。

エストロゲンは乳腺発達の間には重要であるホルモンです。エストロゲンはまた、乳癌1の開発、保守、リスク、および治療 ​​において重要な役割を果たしている。エストロゲンは転写因子であり、特定の標的遺伝子を調節するのERへの結合によってその機能を発揮する。 2つの受容体の変異体のうち、ERαは乳癌細胞のエストロゲン依存性増殖に必須である。ほとんどの乳癌は、ERα陽性であり、成長のためのエストロゲンに依存します。これはエストロゲンシグナル伝達およびホルモン受容体陽性乳癌の治療のため、ERα標的になった。 ERαの基本的なメカニズムを理解することは、治療成績を向上させ、治療に対する抵抗性を克服し、乳がんが発展方法を理解することが重要です。 miRNAは、原因転写後遺伝子調節にその大きな影響を細胞機能において重要な役割を果たしている。 miRNAは、19〜24ヌクレオチド短く、一本鎖、最初にプライマリのmiRNA転写産物（プリmiRNA）にRNAポリメラーゼIIによって転写される非コードRNA。それらは、短ヘアピン前駆体のmiRNA（プレmiRNA）へのDroshaにより核内で処理された後、ダイサーによって処理され、細胞質中の成熟miRNAを形成するために一本鎖に分離される。一本鎖の成熟miRNAがRISC複合体を形成するアルゴノートタンパク質に転写される。次いで、miRNAは翻訳を遮断または標的mRNA を分解することによって2転写後調節をもたらす、標的mRNAの3&#39;-非翻訳領域（3&#39;-UTR）とハイブリダイズすることができる。 によるエストロゲンおよびmiRNAの両方が正常であるか破壊されたエストロゲンシグナル伝達に関連するmiRNAを同定する、腫瘍の進行に果たす重要な役割に発展の我々の理解を高め、乳癌の治療を改善するために重要である。 ERαは、タンパク質をコードする遺伝子を制御する方法を十分に理解、拡張がありますがとRNAの規制非コードの詳細は徹底的に調査されていない。乳癌細胞株におけるmiRNAのERα調節を解明することを目的と初期の研究では、同一の細胞株は3-6分析された場合であっても、矛盾する結果が得られている。これは、様々な治療、生物学的な変形、異なる技術の使用、およびmiRNAの小さいサイズはそれらを分析するために挑戦させるという事実の結果であってもよい。ここで、変動及び方法の成果物用のコントロールプロトコルが記述されている。 miRNAはエストロゲンによって調節されるかを識別するために、ERα活性の明確に定義された乳癌モデルのプロファイリングは、最初のステップである。いくつかの細胞株は、臨床的な乳癌の大多数と同様のエストロゲンに依存するヒトERα陽性乳癌腫瘍から生成されている。 ERαおよびその下流標的の発現を含むこれらの細胞株のうちの2つT47DおよびMCF7の分子特性、プロゲステロンホルモン受容体（PR）、膜受容体HER2の発現の欠如は、エストロゲン応答及び管腔の上皮分化遺伝子の発現とともに、乳房腫瘍7-10の管腔サブタイプのモデルは、それらに適したものにする。 17β-エストラジオール（E2）は、エストロゲンの主要な形態であり、ERαの転写活性化のための最適な濃度および時点は、複数の研究において特徴付けられている。このプロトコルでは24時間、10nMのE2処理は、乳癌細胞におけるERα1活性のためのモデルとして使用され、T47D及びMCF7れる。また、時間依存性のmiRNAの規制は、具体的には、例えば 1〜72時間の時間間隔で分析することができる。 第二に、分析のmiRNAは、その短いサイズに部分的には、別々の課題があります。定期的なグアニジンthiocyanate-phenol/chloroform/isopropanolたRNA沈殿を行った場合、またはSTれるときmiRNAは良く、全RNA調製に保持されていませんandard列精製は使用されている。特別な措置は維持またはRNAの小さな部分を濃縮するために注意する必要がある。遠心分離（-80°C）の前に温度を下げ、イソプロパノールの体積を増大し、70％エタノールでの洗浄を省略することにより、miRNAの保持は、沈殿中に向上させることができる。あるいは、miRNAを含むトータルRNAの高品質と堅牢調製のための特定の列および緩衝液を用いることができる。また、分析の自身のために、彼らの短いサイズは、課題を作成します。マイクロアレイ、定量PCR、次世代シーケンシング：ゲノムワイドなmiRNAスクリーニングのために、3つの一般的な中から選択する技術をプロファイリングmiRNAがあります。各技術は、アーチファクトを導入する別のリスクにそれぞれ、複数の異なるプラットフォームを使用して行うことができ、異なるサンプル調製が必要である。 miRNAのマイクロアレイでは、スライドは、オリゴヌクレオチドの数千でスポットまたは合成さ​​れる。これらのオリゴヌクレオチドはプローブとして使用され、プローブの各々sが、特定のmiRNA配列にハイブリダイズするように設計されている。この研究で実行されるようにマイクロアレイのためのサンプル調製は、最初のmiRNAのために豊かにしてからのmiRNAの上のCy5およびCy3ラベリングを紹介します。マイクロアレイは、同時に多数の遺伝子の相対的発現レベルを観察する機会を与え、迅速かつ多数の試料をスクリーニングするのに適しているが、唯一のマイクロアレイ上に配列が存在し、分析することができ、 例えば、変化を検出しないであろう未知のまたは変異miRNAは。このプロトコルで実行されるようなマイクロアレイ分析はまた、分析用試料当たりの全RNA、比較的大量の、約5μgを必要とする。低密度のqPCR miRNAプロファイリングは、少ない材料（700 NG /サンプルおよび複製）を必要とし、miRNAの検出および定量化を可能にします。転写レベルを決定することができる、および量は、絶対量又は相対量であることができる。 qPCR分析は、第ここでループを用いて、cDNAへのmiRNAの変換を必要とするだけ成熟したmiRNAの解析を確実にそれぞれの特定のmiRNAのためのプライマー。これは、miRNA特異的順方向プライマーおよびループ配列に相補的なユニバーサルリバースプライマーを用いて増幅することができる、より長いテンプレートを生成し、その特異性について二重標識プローブの包含を抱くことができる。定量PCRは、数百のmiRNAが、各々のウェル11内の個々のプライマー対を有する1つまたはいくつかの384ウェルプレートを用いて並行して検出することができる低密度形式で使用することができる。次世代シークエンシングは、一方では、試料中の全てのRNAが11を配列決定することができるように新規な変異または編集されたmiRNAの発見を可能にするこれらの技術のみである。しかしながら、この技術は、低分子RNAを豊かにし、それらのサンプル間の相対的な発現レベルを調節する後続の強化されたリスクにリンカーライゲーションおよび精製のいくつかのステップを使用して小RNAライブラリーを生成するために複数のステップを必要とする。それはまた、有意なbioinformatiを必要とCS分析。 miRNAプロファイリングのための様々な技術を考えると、最も適切な方法は、アプリケーションによって異なります。材料は比較的豊富で、関心は既に知られているmiRNAの発現差を定義するときにマイクロアレイが最も適しています。試料の限られた量が使用可能であり、低発現miRNAの高感度が要求される場合に、低密度のqPCRアレイが最も適している。配列決定により、変異した未知のmiRNA、またはmiRNAの異なるアイソフォームの分析が必要な場合に最適です。 乳癌におけるエストロゲン制御されたmiRNAの研究では、2つのモデル細胞株は、大量のRNAは、容易に入手可能であるT47D及びMCF7を、使用されている。各細胞株は、治療の技術的反復において、それぞれ異なる通路を使用して、複製された細胞培養物中で分析した。これは再現性、ERα調節性miRNAの堅牢な検出を可能にする。相対的なmiRNAの発現レベルは、両方のmiRNAマイクロアレイを用いて比較した二重標識プローブ - 低密度アレイ（DLP-LDA）とシアニン色素とDLPの化学的性質の両方を使用して、特定の定量PCRの結果を検証しました。 miRNAの規制はその後さらにエストロゲン誘導規制からランダムまたは概日変動を差別化し、二次的効果から主な効果を示すことができます時間をかけてその正確なレギュレーションを定義するために、時系列で分析した。 ERαのクロマチン結合の研究とバイオインフォマティクスの比較は二次的影響に対する原発の分化をさらに助けることができます。アッセイは、それが24時間のE2処理タンパク質をコードする転写産物の後に容易に調節されたが、成熟したmiRNAは1に影響を与えていなかったことを確立することができたのmiRNA規制の信頼できる評価が得られた。しかしながら、選択されたmiRNAの1の時系列分析で実証されるように、miRNAは後述の時点で調節されることが可能である。詳細はさらに検討する必要があり、ここに提示プロトコルはローバスを提供乳癌細胞株における成熟miRNAのホルモン調節を研究するためのtの方法。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ<td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ11765054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>F0926-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン</td><td>ライフサイエンス</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドフリーDMEM&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 11054020</td><td></td></tr><tr><td>超純水</td><td>EMD ミリポア</td><td>専用機器</td><td></td></tr><tr><td>DCC-FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6765-500ML</td><td></td></tr><tr><td>100x L-グルタミン</td><td></td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>PBS錠</td><td>メディカゴ アキュレイテッド ケミカルズ</td><td>アキュレイテッド (BF092051-100) メディカゴ (09-9400-100)</td><td></td></tr><tr><td>17&beta;-エストラジオール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr><tr><td>ICI 182,780&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4409</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-600ML</td><td></td></tr><tr><td>T47D または MCF7 細胞株</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>T47D (ATCC HTB-133) および MCF7 (ATCC HTB-22)</td><td></td></tr><tr><td>T-75 フラスコ&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>BD353136 (ベントキャップ)</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipet</td><td>VWR International LLC</td><td>53300.5mL (53300-421)</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting chamber</td><td>Life Technologies</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Life Technologies</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>100 mm プレート用&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>グアニジニウム チオシアン酸フェノール溶液 (TRizol)</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ゴムセル スクレーパー&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>82050-470</td><td></td></tr><tr><td>グアニジニウム チオシアン酸フェノール - クロロホルム法 (miRNeasy Mini Kit/Trizol)</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-Free DNase I&nbsp; kit (DNA degradation)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water (Nuclease-free water)</td><td>Thermoscientific</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000 Spectrophotometer&nbsp;</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>アジレント RNA 6000 ナノアッセイキット</td><td>アジレント</td><td>5067-1512</td><td></td></tr><tr><td>アジレント 2100 バイオアナライザー</td><td>アジレント</td><td>G2938C およびソフトウェア用(G2946)</td><td></td></tr><tr><td>すべてのプライマー(TaqMan プライマーを除く)</td><td>統合 DNA テクノロジー</td><td>各遺伝子/miRNA</td><td></td></tr> <tr><td>の注文ごとに特定First strand buffer, DTT, dNTPs, Superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 18080085</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 96ウェル反応プレート&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ4346906</td><td></td></tr><tr><td>高速光学接着剤は</td><td>、ライフテクノロジー</td><td>ズ4311971</td><td></td></tr><tr><td>2x SYBRグリーンPCRマスターミックス(シアニン染料)</td><td>をカバーしますライフテクノロジー</td>ズ<td>4385612</td><td></td></tr><tr><td>7500高速リアルタイムPCRシステムとソフトウェア</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ4351106</td><td></td></tr><tr><td>&mu;Parafloマイクロ流体バイオチップ技術&nbsp;</td><td>LCSciences</td><td>MRA-1001 and AS-2001(結果解析用)</td><td></td></tr><tr><td>DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (RT primers/Human pool set)</td><td>Life Technologies</td><td>4400928</td><td></td></tr><tr><td>Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCRシステム 9700サーモサイクラー</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 4310899</td><td></td></tr><tr><td>デュアルラベルプローブ(TaqMan) 2x ユニバーサルPCRマスター ミックス-No AmpErase UNG</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 4324018</td><td></td></tr><tr><td>7900HT 高速リアルタイムPCRシステム</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>4329001</td><td></td></tr><tr><td>SDSおよびRQマネージャーソフトウェア</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ</td><td></td>4444202</tr><tr><td>NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit</td><td>Life Technologies</td><td>MIRC-50</td><td></td></tr><tr><td>10x DPL (TaqMan) RT プライマー</td><td>Life Technologies</td><td>各 miRNA</td><td></td></tr><tr><td>20x DPL (TaqMan) リアルタイムアッセイプライマー&nbsp;</td>各<td>miRNA</td><td></td>特有の<td>生命技術</td></tr></tbody></table>

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロrnaのプロファイリング

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

エストロゲンは乳腺発達および乳癌進行において重要な役割を果たしている。これは、に結合し、エストロゲン受容体（ERの）を活性化することによってその機能を媒介ERαおよびERβ。 ERαは、しばしば、乳癌においてアップレギュレートし、乳癌細胞の増殖を駆動する。 ERは、転写因子として機能し、遺伝子発現を調節する。タンパク質をコードする遺伝子のERαの規制が十分に確立されているのに対し、マイクロRNA（miRNAを）の非コードの、その規制が少ない探検です。 miRNAは、それらの翻訳を阻害すること又はそれらのmRNAを分解する遺伝子の転写後調節において主要な役割を果たす。 miRNAは、癌遺伝子や癌抑制として機能することができ、また、バイオマーカーを期待されている。利用可能なmiRNAアッセイの中で、マイクロアレイおよび定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）は、広範囲のmiRNAレベルを検出および定量するために使用されている。乳癌、目にエストロゲンシグナル伝達によって調節されるmiRNAを同定するためにERα陽性乳癌細胞株をμParafloマイクロ流体マイクロアレイおよびデュアル標識プローブ低密度アレイの両方を使用して、エストロゲンの活性化の前後で比較したEIR発現。結果は、シアニン色素系および二重標識プローブベースの化学の両方を適用し、特定の定量PCRアッセイを用いて検証した。さらに、時間ポイントアッセイは、経時的に規則を識別するために使用した。本研究で使用したmiRNAアッセイアプローチの利点は、それがさらに制限されたサンプル量で、多数の試料中の成熟miRNA規制の高速スクリーニングを可能にすることである。特定の細胞培養のための条件とエストロゲン治療、生物学的および技術的反復、および大規模なスクリーニングを含むレイアウトは、別々の技術を使用して、詳細な確認をした後、miRNAの規制のロバストな検出が保証され、偽陽性やその他の成果物を除去します。しかし、変異または未知のmiRNA、またはプライマリおよび前駆体転写産物のleveの規制Lは、検出されません。ここで紹介する方法は、エストロゲン媒介miRNA調節の徹底的な調査を表しています。

アプローチの概観を図1に提示され、様々な試料調製および各技法に必要な核酸修飾の比較を図2に視覚化される。 ホルモンを用いた治療前の細胞の状態や環境ホルモン16の実際の効果を決定するのに重要である。いくつかの培地および血清は、結果に影響を与える可能性の成長因子を含有するので、細胞は、全てのホルモンの影響が最小限に抑制されていることを確認するために、血清飢餓状態である。 E2で処理する場合に従って、観察された効果は、E2-関連することを、より確実性がある。重要な因子は、細胞 - 細胞接触および例えば細胞 - 細胞シグナル伝達および増殖などの行動に影響を与える細胞の密集度である。細胞を、80％コンフルエント（ 図3A）であることが許され、よく成長を可能にし、その後の洗浄およびメディアchの中の細胞の損失を回避するために取り付けられたANGE。 RNA抽出および貯蔵中の条件は、RNAの品質およびその後の分析のために重要である。また、細胞数、抽出方法、およびmiRNAのGC含量がmRNAおよびmiRNAの17の両方の収量と品質に影響を与えることが知られている。したがって、RNaseフリーの状態の間にRNA抽出を実行し、実験を開始する前に、RNAの品質を確認する必要がある。抽出後、RNAの定量化は収率の観察を可能にするトータルRNA（mRNAおよびmiRNAの両方を含む）の濃度に関する情報を提供する。また、 図3Bに示すように、結果のグラフィック表現を提供し、これは（通常は一つのピーク、上部パネルで示される）試料の純度の観察を可能にする。 RNAの貧しい収量は260 nmの（ 図3B、下のパネル）で特定の吸収を生じないでしょう。 RNAは、高品質でRNAであるかどうかを確認するには整合性を測定した。 9月10日の間のRNA完全性番号（RIN）は、RNAが分解されない、最適な品質であることが保証されます。また、RNAのグラフィカル表現が観察されるべきであり、 図4（中央パネル）に示すように、18Sおよび28S rRNAがピークを有するべきである。ラダー（ 図4、上のパネル）と比較すると、ピークの大きさを識別します。分解されたRNAは、それほど明確なピークおよび18Sおよび28S rRNAの（ 図4、下のパネル）の減少した相対的な量を持っているでしょう。小さなRNAの画分をさらにアジレントスモールRNAキットを使用して確保することができる。それは、miRNAのスクリーニングに進む前に、指定された実験条件下で、治療後のエストロゲン応答を検証することをお勧めします。定量PCRは、cDNAテンプレートを使用して、例えば、pS2の又はSPINK4 18として知られているER標的遺伝子に対して行うことができる。このような遺伝子は、通常のE2処理後の1月24日時間以内にアップレギュレートされる。 RNAの品質とエストロゲン応答回さらなる実験を行うことができ、評価されている。 マイクロアレイは依然として細胞におけるmiRNA発現のための大規模なスクリーニングのために広く使用される技術である。例えば、一度使用したmiRNAマイクロアレイは四つ子1の894の成熟miRNAと50のコントロール独自のプローブを含んでいた。ハイブリダイゼーションは、色素スワップ手順で重複して行った。 miRNAのマイクロアレイの結果は、通常、グラフィカルヒートマップにより表される。 図5Aは 、車両及びE2処理サンプル間でのmiRNAマイクロアレイの比較からのデータを表すヒートマップを示している。赤は緑がmiRNA（下式）のダウンレギュレーションを示しながらのmiRNAは、E2処理試料（より高い発現）に上方制御されることを示しています。 miRNAの選択は、通常、発現におけるそれらの重要性に依存するが、通常0.05以下のp値未満を有意と考えられる。示差的に発現することが示されているmiRNAは、さらにワット検証する必要がありますi番目の定量PCRは、偽陽性と区別するため。 DLP-LDAアレイは、一方で、384ウェル形式で調節されたmiRNAをスクリーニングするための定量PCRベースの方法を使用する。通常、2つの384ウェルプレート（カード）プールA、提供されており、B.プールAは、各miRNAの相対レベルは、1つのmiRNAがにつき分析する定量PCRにより決定されるプールBよりもmiRNAを通常よりよく特徴付け含有し、より高度に発現さウェル（ 図5B）。上位のCt値が低いmiRNA発現を示している。多くのmiRNAマイクロアレイのように、DLP-LDAから得られた結果は、さらに精度を確保するために検証される必要がある。 検証をqPCRを用いて行うことができる。ここでは、2つのqPCR検出方法は、方法の偏りを防ぐために、徹底した確認およびmiRNA規制の調査を可能にするために記載されている。シアニン染料ベースの検出化学は、DLP-LDAプロファイリングの基になっているのDLPとは異なる動作し、確認のために適していますATION目的。それは、すべての増幅された二本鎖DNAを検出すると、それはあまり特異的であり得るが、サンプルの均質性は、融解曲線分析を行うことにより評価することができる。 図6A（左パネル）miRNAの融解曲線分析を示す図であり、a明確に定義された均一なピークが見られる。プライマーは、プライマー-ダイマーの非特異的又は有意な量である（ 図6A、右パネル）が形成されている場合は、複数のピークが観察されるであろう。一方、DLPのmiRNAアッセイは、miRNAのが検出されたターゲットの唯一の増幅など、より具体的である。 図6Bに例示されるように、各ターゲットmiRNAの増幅プロットを観察することができる。融解曲線分析を使用して、複数の増幅産物の発生を制御するためのオプションが、この化学的性質を有するが、利用できず、シアニン色素定量PCRは、安価である。シアニン色素やDLP定量PCRアッセイは、時々わずかに異なる結果を生成します。定量PCRアッセイ、REFEとの比較の両方についてrence遺伝子は、2つのサンプル間の遺伝子の相対的発現を決定するために必要とされる。また、ハウスキーピング遺伝子とも呼ばれる参照遺伝子は、その発現が変更されず、目的の遺伝子と同様のレベルで発現される遺伝子であるべきである。これらの乳癌細胞株における適切な参照遺伝子の例は、ARHGDIA、Rhoタンパク質のGDP / GTP交換反応が機能するのRho GDP-解離阻害剤である。 図6C（上）で観察されたように、ARHGDIAのmRNAレベルは、車両およびリガンド処理試料との間で変化しない。その高発現するcDNAストックの別々の1:500希釈を必要とするので、あまり適切ではあるが、18S rRNAのも、使用することができます。 miRNAの分析のために、明確に定義された参照遺伝子についての議論が依然として存在する。今のところ、U6 snRNAを広くmiRNAの分析のために受け入れられている参照遺伝子である。 U6 snRNAを核プレ-mRNAのsplで機能〜110ヌクレオチド長、小さい非コードRNAである核アイシング19。 図6C（下）で観察されたように、U6発現レベルは、このように、miRNAの可変レベルの計算を可能にする、示されたすべてのサンプルにわたってほぼ同じである。 U6基準に正規化されている車両およびE2処理細胞との比較のためのmiRNAのqPCR結果のグラフを図6Dに観察することができる。これは、24時間の処理後にE2非規制として検出されたmiRNAを示すが、そのゲノムの場所の近くにERクロマチン結合部位を保有し、時系列分析は、治療後に有意レギュレーション72時間を同定する。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1.jpg" /> 図1。乳癌細胞におけるmiRNAのホルモン調節の検出のために用いられる方法の概要。 </strオング&gt;プロセスは、大規模なmiRNAは、おそらく差次的に発現miRNAを同定するためにプロファイリングした後、細胞培養および治療から始まり、配列結果の定量RT-PCR法の検証で終わります。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2.jpg" /> 図2。各miRNAの検出技術のための様々な試料調製および核酸操作の比較。 （A）μParaflo技術の方法を用いてmiRNAのマイクロアレイは、濃縮、ポリ-テーリングおよび連結標識を含む。（B）DLP技術サンプル調製および検出方法は、変性工程の後に延びるループcDNA合成プライマーを含み、保有するより長い断片を提供するリバースプライマーとプローブ配列（C）シアニン染料技術サンプル調製及び検出方法は、ポリA-テーリング、ユニバーサル5 &#39;配列を含むオリゴ-dTプライマーによるcDNA合成を含む。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3.jpg" /> 図3。細胞培養およびRNA抽出。 （A）の配位子で処理する前に必要とされる80％の密集度を説明するための培養細胞（B）抽出後のRNAの濃度および純度のグラフ表示。各ピークは、試料を表し、成功した抽出プロセスは、純粋なRNA（上部パネル）を得る。不十分抽出したRNAを、260nm（下のパネル）での明確な吸収ピークを示さない。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4.jpg" /> 図4。＆＃160; RNAの品質管理ラダー（上）、良好な品質のRNA（中央）とに分解したRNAサンプル（下）のためのグラフィカル表現を示すRNA完全性の分析からの結果。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5.jpg" /> 図5。 miRNAプロファイリングの結果の図。 （A）示差的に発現されるmiRNAに対するmiRNAマイクロアレイ結果のヒートマップ表現。赤で示されているように緑色で示されているようにするmiR-D、E、F、GはE2処理サンプルで下方制御されている間は、miR-A、B、Cは、E2処理された試料においてアップレギュレートされている。各々に対する（B）の増幅プロットをDLP-LDAの結果からのmiRNA。 Rnの値の増加によって示されるように検出されたmiRNAは、増幅される。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" fO：SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6.jpg&quot; /&gt; 図6。 miRNAの規制のqPCR分析。（A）融解曲線分析のmiRNAのために、試験した全てのサンプルの均質性（左）と、複数の断片（右）の増幅を示す、シアニン色素検出を用いて分析した。（B）は、各サンプルについての増幅プロットをmiRNAは。これは、シアニン色素、またはDLPの検出方法の中からいずれかになります。サンプル間の有意な発現差異を示さないmRNAを解析ARHGDIA（上）用およびmiRNA解析のsnRNA U6の（下）のための適切な参照遺伝子の（C）のバーグラフ表示、（D）時間経過にわたってのmiR-135aの相対的な発現レベルの比較を説明するためのmiRNA qPCRの結果は。 図6Dは、エルゼビアの許可を得てKatchy ら 1から復刻されています。値は、通常、別々のexperの平均であるSD±iments（生物学的重複）。 *はp &lt;0.05：Studentのt検定を、有意性を実証するために使用される。

エストロゲンとマイクロRNAの両方を介したシグナル伝達分子は、乳がんの発展と成長において重要である。エストロゲンは転写因子であるエストロゲン受容体を活性化する。多くの転写因子は、マイクロRNAの発現を調節することができ、エストロゲン調節マイクロRNAは、異なる大規模な技術を用いてプロファイリングすることができる。

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

この手順の全体的な目的は、エストロゲン受容体が制御する可能性のあるmicroRNAを特定することです。まず、最適なコンフルエンスまで培養し、エストロゲン活性を除去することで、細胞を最大限のエストロゲン反応が得られる状態に準備します。次に、エストラジオールを用いて規定の時間点で処理し、エストロゲン受容体の転写活性を誘導します。比較のために適切なコントロールを含めます。次に、マイクロRNA集団を含むRNAを抽出し、エストロゲンによって調節されることが知られているcDNAに変換します。その後、QPCRを用いて標的遺伝子を測定し、処理プロトコルが成功したことを確認します。最終ステップでは、大規模スクリーニング技術を用いてゲノム全体のmicroRNA発現パターンを決定します。最終的に、qPCRを用いた確認分析が行われます。この手法は、エストロゲンがmicroRNAの発現に影響を与えるか、またどのように影響するかなど、乳がん研究分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法は乳がんに関する知見を得るのに役立つだけでなく、エストロゲン受容体αまたはβを発現する他の癌や細胞型などの他の系にも適用可能です。本研究で使用したMC7細胞は、処置の5日前に無菌フード内で調製します。真空ポンプに接続した滅菌パスツールピペットを用いて、T75フラスコから培地を除去します。付着した細胞をPBSで2回緩やかに洗浄し、トリプシンを用いて細胞を剥離させます。メーカーのプロトコルに従い、細胞計数計で細胞数を計測します。6枚の100 mLプレートにラベルを貼り、各プレートに10 mLの培地を加えます。1プレートあたり約200万個の細胞を播種し、プレートを緩やかに揺らして細胞を分散させます。細胞が約80%コンフルエントになるまで、37°C、5% CO2の条件下で24〜48時間インキュベートします。2〜4日後、細胞を37°Cのインキュベーターから取り出し、顕微鏡下で観察して、約80%コンフルエントであることを確認します。細胞のコンフルエンシーは、細胞間接触や、細胞間シグナル伝達および増殖などの挙動に影響を与えるため、重要な要因となります。細胞をPBSで2回洗浄し、エストロゲン化合物を除去するためにろ過した5%FBSを含む適切な培地を添加します。デクストランコート炭酸処理FBS（D-C-C-F-B-S）を用いて、細胞を37°C、5%CO2条件下で24時間インキュベートし、翌日に移行します。細胞をPBSで2回洗浄し、適切な0.5% D-C-C-F-B-S培地を加え、処理当日にさらに48時間インキュベートします。50 mLコニカルチューブを用いて、細胞処理用の試薬を調製します。まず、適切な0.5% D-C-C-F-B-S培地を30 mL加え、次に0.1 mM E2リガンドストック液を3 µL加えます。細胞をPBSで2回洗浄します。PBSを可能な限り除去してください。各チューブの内容物を静かに混ぜ合わせ、各プレートの細胞に10 millilitersずつ添加します。1プレートにつき1種類のリガンドを用いてください。細胞を37°C、5% CO₂の条件下で、0時間から72時間の間で任意の時間インキュベートします。所定期間の処理完了後、必要に応じて培地を交換してください。プレートをインキュベーターから取り出し、ドラフトチャンバーへ移動させます。この手順では毒性のあるグアニジンチオシアネート・フェノール溶液を使用するため、適切な個人用保護具を着用してください。細胞をPBSで2回洗浄します。次に、各プレートの細胞にグアニジンチオシアネート・フェノール溶液を1〜2 mL加えます。細胞の体積がグアニジンチオシアネート・フェノール溶液の体積の10%を超えないこと、およびプレート全体が溶液で覆われていることを確認してください。細胞を1分間静置します。次に、ラバースクレイパーを用いて細胞を掻き出し、マイクロ遠心チューブに移します。細胞はこの溶液中で-80°Cで数週間保存することが可能です。本手順を成功させるためには、高品質なRNAを抽出することが非常に重要です。したがって、以降の工程はRNaseフリー条件下で行う必要があります。各処理区から全RNAを抽出するには、細胞混合液を1分間ボルテックスし、迅速に遠心分離を行います。グアニジンチオシアネート・フェノール溶液1 mLあたり200 µLのクロロホルムを添加します。15秒間ボルテックスし、室温で2〜3分間インキュベートします。11,000 RPM、4 °Cで15分間遠心分離します。上層の水相を新しいマイクロ遠心チューブに回収します。1.5倍量の100%エタノールを加え、ピペッティングで混ぜ合わせます。溶液をスピンカラムに移し、メーカーのプロトコルに従ってmicro RNAスピンカラム精製を行い、続いてDNase IによるDNA分解を行います。その後、RNAを60 µLのRNaseフリー水に再懸濁し、1〜2 µLのRNAを定量および品質分析に使用し、残りのRNAは-80 °Cで保存します。細胞の処理により、mRNAなどの既知のエストロゲン応答標的の制御が起こったことを確認した後、 micropower flow マイクロフルイディクス、マイクロアレイ、および二重標識プローブ（低密度アレイ、または D-L-P-L-D-A）を用いてマイクロRNAプロファイリングを行います。D-L-P-L-D-A を用いてマイクロRNAプロファイリングを行うには、D-L-P-L-D-A プレートを冷蔵庫から取り出し、RNAサンプルから cDNA を生成するための逆転写反応を行っている間に室温に戻しておきます。D-L-P-L-D-A プレートが室温に達したら、二重標識プローブおよび PCR マスターミックスと混合した cDNA 100 µL を、プレートの8つの充填ポートそれぞれに分注します。アレイプレートを遠心分離します。qPCRシステムを短時間開き、ブロックが384ウェルプレート用であることを確認してください。ランの設定を行います。SDSソフトウェアを使用して、相対定量を選択します。ウェル番号とアレイタイプを選択し、サンプルの説明を入力してウェルを定義します。デフォルトのサーマルサイクリング条件でアレイを実行します。ランが終了したら、結果を保存し、Microsoft Excelにエクスポートして、以降の解析のために保存します。マイクロRNAの調節を確認する方法の一つに、サイアニドD-Q-P-C-R解析があります。最初のステップは、成熟マイクロRNAの配列に基づいたプライマーを設計することであり、フォワードプライマーに相当する配列はmiRBase.orgから取得できます。すべてのUESをts nextに変換し、CD NAを準備します。1.5 mL遠心チューブに1 µgの全RNAを分注します。全RNAの代わりに水を用いたネガティブコントロールを含めてください。poly Aテール付加および第1ストランドCD nnaの手順に従ってください。マイクロRNAの第1ストランドcDNA合成およびqRT-PCRプロトコルによるマイクロRNAの合成。得られたcDNAを精製水で10倍に希釈し、-20 °Cで保存する。96ウェル反応プレートを用意する。qPCRマスターミックスを調製します。各マイクロqPCRマスターウェルに、特異的フォワードプライマーおよびユニバーサルプライマーをそれぞれ2 pMずつ、2X qPCRマスターミックス 5 µL、および精製水を加えます。混合液を各ウェルに分注します。最後に、各サンプルに16 ngのpoly A cDNAを加え、陰性コントロールも含めます。最終反応量は1ウェルあたり10 µLとなるようにしてください。テクニカルレプリケートとして、各サンプルおよび各microRNAについて、また陰性コントロールについても、3連（triplicate）のウェルを確保してください。さらに、通常は U6 snRNA や、qPCR システムソフトウェア上で変動しないマイクロRNAなど、1つまたは複数のリファレンス遺伝子を含めます。リポーターとターゲットを指定し、反応量を入力します。比較Ct法（comparative threshold cycle method）を選択し、サンプルウェルを定義してください。デフォルトの設定を使用してプレートのランを実行します。ランの完了時に、すべてのシアン染料のランで融解曲線分析が行われることを確認してください。結果を保存し、CT値を含むすべてのデータをMicrosoft Excelにエクスポートします。サンプルから高品質なRNAを効率的に抽出することは、本研究を成功させるための重要な要因です。抽出後、この代表的な結果に示されているように、分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。上パネルに描かれている各ピークは、サンプルと、純粋なRNAが得られた良好な抽出プロセスを表しています。対照的に、下パネルに示されている抽出不十分なRNAでは、260 nmに明確な吸収ピークが見られません。RNAの品質管理のためにRNAの完全性を測定し、その結果をRNAラダーと比較しました。ここで示されているように、高品質なRNAサンプルでは、18 Sおよび28 S-R-R-N-Aにピークが見られるはずです。分解されたRNAサンプルでは、ここに示すように、ピークが不明瞭になり、18 Sおよび28 S-R-R-N-Aの相対量が減少します。マイクロRNA集団の解析は個別に実施可能です。対照群（vehicle）とE2処理群のサンプルを比較したマイクロRNAマイクロアレイの結果を、このヒートマップで視覚的に示しています。赤色で示されているように、mere a、mere B、およびmere CはEの2つの処理サンプルで発現が上昇しており、一方で緑色で示されているように、mere D、mere e、mere F、およびmere GはEの2つの処理サンプルで発現が低下しています。マイクロRNAの選択は、それらの有意性と発現量に基づいて行われます。通常、P値が0.05未満であれば有意であるとみなされ、QPCRによるさらなる検証のために選択されるべきです。デュアルラベルプローブ低密度アレイは、A-Q-P-C-R法を用いて制御されたmicroRNAをスクリーニングします。ここでは、384ウェルフォーマットにおけるD-L-P-L-D-Aの結果からのmicroRNA増幅プロットを示します。発現しているmicroRNAの増幅は、RN値の上昇によって示されます。検出手法によるバイアスを防ぎ、マイクロRNA制御の徹底的な確認と調査を可能にするため、2つのqPCR検出法を用いてバリデーションを行うことができます。1つ目の方法は、シアニン色素検出を用いてマイクロRNAの融解曲線分析を行い、増幅の特異性をコントロールとして評価する方法です。目的の断片が増幅されると、左パネルに示すように、明確に定義された均一なピークが現れます。右側のパネルに示されているように、プライマーが非特異的である場合や、一定量のプライマーダイマーが形成された場合には、複数のピークが観察されます。このような場合、そのデータは発現解析に使用できません。2番目の手法であるデュアルラベルプローブを用いたQPCR解析は、標的マイクロRNAの増幅のみが検出されるため、各標的の増幅プロットにおいてより高い特異性を示します。マイクロRNAは、ここに示すように両方のQPCRアッセイで観察できます。2つのサンプル間での遺伝子の相対的な発現量を決定するには、参照遺伝子との比較が必要です。これらの乳がん細胞株における適切な参照遺伝子の例としては、A-R-H-G-D-I-A-A RO GDP解離抑制因子が挙げられます。この図で観察されるように、A-R-H-G-D-I-AのmRNAレベルは、溶媒投与群とリガンド処理群の間で変化していません。マイクロRNA分析において広く認められているリファレンス遺伝子は、U six snrp RNAです。これは約110ヌクレオチドの長さを持つ非コード小型核内RNAであり、核内前駆体にて機能します。この図で観察されるように、U6の発現レベルは示されているすべてのサンプルでほぼ同一であるため、microRNAの変動レベルを算出することが可能です。この最後の図は、対照群（vehicle）およびE2処理細胞におけるmicroRNA-qPCRの結果をグラフ化したものであり、特定のmicroRNAであるmiR-135aの相対的発現レベルを時系列で比較しています。このmicroRNAは、E2処理後24時間までは調節されていませんでしたが、処理後72時間で有意な調節が検出されました。以上の手順に従います。マイクロRNAがCIS調節クロマチン領域への結合を通じて受容体によって直接制御されているかなど、追加の疑問を解消するために、SDR N受容体のクロマチン免疫共沈降などの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、エストロゲンが介在するマイクロRNAの調節を堅牢な手法で分析する方法について十分な理解が得られたはずです。生物学的または技術的な変動ではなく、真の調節を検出していることを確認するためには、本プロトコルに記載されている各種コントロールの実施およびステップの繰り返しを行うことが非常に重要です。

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